石榴叶乙醇水提取物的抑菌杀虫活性研究

第13卷第2期潍坊学院学报VoL 13 No. 22013年4月Journal of Weifang UniversityApr.2013石榴叶乙醇水提取物的抑菌杀虫活性研究王东方12,谷鹏2,柏显首12,王庆忠,2(1.山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室,山东潍坊261061;2.潍坊学院,山东潍坊261061)摘要:用索氏提取法以乙醇水加热提取石榴叶的有效成分,并对提取物的抑菌作用和对果蝇与槐蚜触杀活性进行了探究。结果表明,石榴叶提取物对革兰氏阳性菌(白色葡萄球菌)有明显抑制作用,其有效抑菌浓度值为40mg/mL;对果蝇的药理作用明显,数据变化显著,有上升趋势;对槐蚜有明显的触杀活性,其LC50为.10.4203mg/mL。因此,石榴叶提取物对革兰氏阳性菌及昆虫有良好的抑菌杀虫效果关键词:石榴叶;提取物;生物活性;细菌;果蝇中图分类号:S482.1文献标识码:A文章编号:1671-4288(2013)02-0044-04石榴叶为石榴科植物石榴( punica granatum L)的叶。石榴叶具有收敛止泻、解毒杀虫功效,主治泄泻、痘风疮、癞疮、跌打损伤,在埃及作为传统的药材。以前的研究表明,科学研究者对石榴叶化学成分进行了许多研究,取得了较大进展,石榴叶中含有20多种化合物,包括熊果酸、白果酸、白桦脂酸、甘露醇、菟资单宁、鞣花单宁以及黄酮苷类等。石榴叶水浸剂能显著增强大鼠胃蛋白酶活性,促进胆汁分泌,并可以加强大鼠小肠蠕动;能显著抑制大鼠胃液分泌和总酸排出量12。研究还观察到石榴叶水浸剂对大鼠试验性胃溃疡的作用,能显著降低大鼠胃溃疡发生率,并减少胃溃疡面积和降低胃溃疡程度。石榴叶水提取物在调节血脂清除氧自由基等方面也有活性,具有调脂作用的活性成分是石榴叶鞣质,在体外试验中,石榴叶鞣质能明显抑制还原酶活性,石榴叶鞣质的效价较辛伐他汀强100倍左右,同时也提示了石榴叶鞣质降低胆固醇的作用机制,部分与抑制该酶活性有关3;鞣质能凝固微生物体的原生质及多种酶因而对各种细菌和真菌有抑制作用。临床研究已经证实石榴皮对淋球菌有明显的抑制作用。但石榴叶提取物的抑菌杀虫活性未见报道。本研究用乙醇水提取石榴叶的有效成分,并对其生物活性进行了研究。1材料和方法1.1材料与仪器石榴叶采集于潍坊学院校园内;大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和白色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)菌株取自潍坊学院生物与农业工程学院微生物实验室,菌种斜面培养进行繁殖;成年雌雄黑腹果蝇取自遗传实验室后在微生物实验室内扩代培养了;槐蚜采集于潍坊学院校内。主要仪器有800A型中药粉碎机(青州市精诚医药装备制造有限公司)、RE-5299旋转蒸发仪、SHZ-IA循环水真空泵(上海一凯设备有限公司)、CJ一1680型超净工作台,YsQ.SG41.280型手提式压力蒸汽灭菌锅、低温冰箱、指形管等。主要试剂有乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司生产)、二甲基亚砜(DMSO)(国药集团化学试剂有限公司)链霉素、青霉素;牛肉膏、蛋白胨、琼脂;蔗糖Nac、甲醇、HCl、NaOH等。以上药品均为AR级。1.2石榴叶提取物的制备石榴叶经清洗和晾干;烘箱中65℃烘干后,用中药粉碎机粉碎15~30s;称取100g粉末置入索氏提取装置的烧瓶中,加入75%乙醇500ml,在电磁恒温搅拌器上搅拌煮沸回流萃取2h;真空抽滤后用旋转蒸发仪40℃浓缩至干;称重后用10%DMSO配制成配制成浓度为60mg/ml储存液备用。*收稿日期:2013-01-12基金项目:山东省自然科学基金(zRc05);濉坊市科技发展计V中国煤化工学术团队项(2010Z03)CNMHG作者简介:王东方(1970-),男,山东昌乐人,濉坊学院生物与农业工程学院副教授。研究方向:微生物生理生化功能配合物化学。第2期王东方,谷鹏,柏显首,王庆忠:石榴叶乙醇水提取物的抑菌杀虫活性研究1.3石榴叶提取物的抑菌活性测定将培养基制成平板,细菌用牛肉膏蛋白胨培养基。用无菌生理盐水把各种菌种(大肠杆菌和白色葡萄球菌菌种配制成106~103个/L孢子悬液吸取0.2mL孢子悬液均匀涂抹到灭菌平板上。用10%DMSO将石榴叶提取物配制成浓度分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L60mg/L的溶液。将直径约0.4cm滤纸圆片置于各质量浓度的溶液中浸泡将浸渍过提取物溶液的滤纸片风干,放到每个涂有菌液的平板上,等距离放4片,每个试验平行3次,文中所列数据为平均值。细菌培养在37℃下24h。测定抑菌圈直径大小,并用无菌水作空白对照(以CK表示),以直径大于1.00cm为有效果来确定抑菌效果∽。以上操作均在无菌条件下进行用10%DMSO分别配制链霉素、青霉素各浓度。链霉素:30u/mL、50u/mL、80u/mL、100u/mL、150u/mL、200u/mL;青霉素:10mg/L、1mg/L、10-1mg/L、10-2mg/L、10-3mg/L。作为参照,将直径约0.4cm滤纸圆片置于各质量浓度的溶液中浸泡将浸渍过提取物溶液的滤纸片风干,放到每个涂有菌液的平板上,等距离放4片,每个试验平行3次,文中所列数据为平均值。细菌培养在37℃下24h。测定抑菌圈直径大小,并用无菌水作空白对照(以CK表示),以直径大于1.00cm为有效果来确定抑菌效果。以上操作均在无菌条件下进行71.4石榴叶提取物对果蝇的毒理活性测定研究石榴叶提取物对果蝇的影响方案常采用棉球饲喂法③(1)配制果蝇培养基,饲养繁殖黑腹果蝇。(2)供试饲养液的制备:用2%的蔗糖水溶液作为对照培养液;在2%的蔗糖水溶液中加入不同量的石榴叶提取物,配制成一定浓度梯度:1、2、3、4、5及10mg/ml。(3)果蝇毒性试验:供试果蝇为黑腹果蝇成虫用乙醚麻醉后,饥饿5~6h后饲以不同浓度的供试溶液,准备10个指形管,每指形管中放置一个0.2g的脱脂棉球,棉球上蘸有大约2.5mL饲养液,各指形管中接入大约25头果蝇,设置5次重复,用2%的蔗糖水溶液作为对照组,所有的指形管置于温度25℃、相对湿度为50~60%光照周期为12D/12L的培养箱中,连续饲养4d,每12~13h记录各处理的死亡果蝇数,4d统计汇总各组果蝇死亡数1.5石榴叶提取物对槐蚜的杀虫活性测定石榴叶提取物的杀蚜活性测定采用室内叶片法。采集虫口密度大的国槐枝叶带回实验室,选择带蚜叶片,剔除不合格的虫,以大小适中的健康无翅成蚜为试虫,并将带虫叶片修剪为每片25头虫左右,置于铺有滤纸的培养皿中。用10%DMsO水溶液梯度稀释石榴叶提取物储存液,并喷洒于各个试验皿中,以10%DMSO水溶液作为对照,然后置于温度为25℃、湿度为80%的培养箱内培养,24h后统计蚜虫死亡率。每浓度3次重复,死亡率以3次重复的平均值计。0死亡率(%)=过电死数×100校正死亡率%)=处理组死亡率2)元对组死亡率×1002结果2.1石榴叶提取物对魄葡萄球菌有摄制活性通过对图1、2和3的分析,可以看出,提取物的成分与青霉素的效果相似,对白色葡萄球菌(即革兰氏阳性菌)有明显摄制活性,而对大肠杄菌(即革兰氏阴性菌)无明显效果。不同链霉素浓度下抑菌圈大小驱1←大肠杆菌白色葡萄球菌中国煤化工0305080100150200链霉素浓度CNMHG图1提取物的抑菌效果潍坊学院学报2013年4月不同链霉素浓度下抑菌圈大小2长遥景大肠杆菌白色葡萄球菌200链霉素浓度图2链霉素的抑菌效果不同青霉素浓度下抑菌圈大小21.5大肠杆菌白色葡萄球菌0.5000.0010.010青霉素浓度(mgm)图3青霉素的抑菌效果2.2石榴叶提取物对果蝇有很强的触杀活性由图4可以看出,提取物对果蝇有很好的触杀作用,浓度越高,死亡数越多。其触杀作用的毒力回归方程Y=0.95515x+10.07,相关系数为R2=0.9635,其LC50=52.36mg/mL。095515x+1007R0963524h累计死亡率(线性②4累计光亡率2010提取物浓度(mgm)图4不同浓度下的死亡率图2.3石榴叶提取物对槐蚜的杀虫活性测定结果由表1可以看出,提取物对槐蚜有很好的触杀作用,20~40mg/mL时,校正死亡率达到89.52%;当浓度为60mg/mL时,校正死亡率达到96.72%。其触杀作用的毒力回归方程Y=-21.28x+120.71,相关系数为R2=0.864,LC为10.4203mg/mL。表1石榴叶提取物对槐蚜的触杀作用(士SEMn=4提取液浓度/mg·mL124h死亡率/%24h校正死亡率/%96.84±1.26.7295.07±1.9486.3士1.277.4±1.438.9士2.1440.35对照3.6士1.74中国煤化工注:△表示与对照组比较差异显著(P<0.05)CNMHG讨论石榴叶提取物对革兰氏阳性菌有明显的抑菌效果,对革兰氏阴性菌效果不明显;提取物对黑腹果蝇成第2期王东方,谷鹏,柏显首,王庆忠:石榴叶乙醇水提取物的抑菌杀虫活性研究虫有明显毒害作用,且毒性效果与浓度呈正相关,可用作除蝇成分。提取物对槐蚜有明显的防治效果,60mg/m1提取物24h后的防治效果达96.72%与目前使用的化学农药吡虫啉的防治效果相比无显著差异(P<0.05)石榴是我国重点发展的经济水果之一,在我国各地均有栽培种植面积正大规模发展。但是在很多地区石榴叶仅作为茶叶饮用,这就造成了严重的资源浪费。在今后,社会应进一步加强石榴叶的药理活性成分研究,为临床研制出一个新的有效天然药物为天然性新药的开发打下良好基础12。石榴叶越来越明确的药理作用已经越来越受到人们的关注,相信随着对天然性药物研究的深入,必将拥有一个更加明亮的开发前景参考文献[1]周建华,胡建平.石榴生物活性物质的研究进展[门.中国酿造,2008,(14):42-44.[2]雷帆,邢东明,向兰,等,石榴叶提取物中鞣花酸在大鼠体内药物动力学研究[门].药品评价,2005,2(1):38-41[3]邓文龙,王浴生,中药药理与应用[M.2版.北京:人民卫生出版社,1998[4]赵彦君,师宝君,胡兆农.杠柳毒素NW杀虫活性[.昆虫知识,2008,45(6):950-952[5]张羽飞,于春丽,张春枝.乙醇室温浸提法提取黄芩总黄酮的工艺条件[]大连轻工业学院学报,2004,23(3):190-193[6]周德庆.微生物学实验手册[M].上海:上海科技出版社,1987[7付良臣,孟昭礼.柳树中用抑菌活性物的初步研究[.当代生态农业,200521(21):113-114[8]王菊凤,李鹄鸣.蛹虫草多糖对果蝇寿命影响的研究[].中国野生植物资源,2008,27(3):38-4[9]杨冬梅,陈玲,龙灿,等.北冬虫夏草提取液对果蝇繁殖力及寿命的影响[].湖南农业科学,2012,(6):87-89[10]王庆忠,王东方,王汉海,等.番茄茎叶乙醇水提取物对槐蚜的生物活性研究[J].北方园艺,2012,(24):147-148[11]刘月,霍清,张盛字,等.爽椿叶提取液对蚜虫防治效果的研究[].北方园艺,2009,(9):94-95[12]卫天星,郭小侠,甘赖丽.西安市行道树主要害虫发生规律及防治研究[J.陕西师范大学学报:自然科学版,2003,增刊93-95The Study of the Ethanol Antimicrobial, Insecticidal BiologicalActivity of the ethanol and water Extract of Pomegranate leafWANG Dong-fang 1.2], GU Peng 1. 2, BAI Xian -shou L1.2), WANG Qing-zhong 1.23(l. Key Laboratory of biochemistry and molecular biology in university of Shandong province,Weifang 261061, China; Weifang University, Weifang 261061, China)Abstract: In present study, the active ingredient was extracted from pomegranate leaf by Soxhlet extraction method with ethanol and water solution accompanied by heating, and the activity of extract against bacteria, Drosophila melanogaster andAleurocanthusspiniferus were studied. The results showed that the pomegranate leaf extract have significantly suppress ofGram-positive bacteria(Staphylococcus albus), the effective inhibitory concentration value ia 40 mg/ml; and it has obvious-ly pharmacological effect on Drosophila with data changes, and rising: With pharmacological effects Cassia aphids value, itsLC50 is 10. 4203 mg/mL Therefore, the pomegranate leaf extract is good antibacterial insecticidal effect on gram-positiveKeywords: pomegranate leaf, extract, biological activity, Bacterial, drosophilas(责任编辑:刘乃生)中国煤化工CNMHG