聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与DNA聚离子复合物胶束的研究

第26卷第4期湖北大学学报(自然科学版)Vol.26 No.42004年12月Joumal of Hubei Universit( Natural Science Edition )Dec.2004文章编号:1000- 23752004 )4-0322 - 05聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与DNA聚离子复合物胶束的研究杨子刚'周芬'袁建军'，马立新2,翟超2程时远'( 1.湖北大学化学与材料科学学院湖北武汉A30062 2. 湖北大学生命科学学院湖北武汉A430062 )摘要将聚(N- 苄氧羰基赖氨酸)-聚乙二醇-聚( N--苄氧羰基赖氨酸I PL(Z)- PEG- PL(Z))冲的氨基去保护得到两端为聚阳离子的嵌段共聚物聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸( PLL- PEG- PLL)并对其与DNA结合形成的聚集体的性质进行了研究.结果表明:PLL- PEG-PLL与DNA形成了聚离子复合物胶束;DNA与PLL通过静电作用形成核,PEC包裹在其外面得到的聚离子复合物胶束为均相体系即使在化学计量点也不会沉淀,保持着很好的流动性和稳定性这--点对基因治疗是很重要的而且随着PLL段的增加,包覆效果更好聚离子复合物胶束使得DNA具有较强的核酶抗性;大小在10~35nm之间呈球形聚离子复合物胶束能够用于基因的传递使基因在昆虫细胞系SF9中能够表达出蛋白质.关键词聚赖氨酸聚乙二醇嵌段共聚物;DNA聚离子复合物胶束中图分类号:0647.2文献标志码:A随着人类基因图谱的绘制完成在不久的将来人类的所有疾病都有可能通过基因进行治疗.然而,其中一个主要的问题就是基因载体的开发,目前,用于基因治疗的载体主要是病毒病毒虽然具有转染效率高的特点但是它存在-个致命的弱点那就是与人体的相容性不好会产生免疫原性存在严重的安全问题1].与病毒载体相比非病毒载体具有无传染性、不限制载体容量.可大量制备等优点而越来越受到研究人员和临床医生的关注.因此非病毒基因载体的研究成为当前的一个研究热点.目前非病毒基因载体主要是聚阳离子[2-8]存在在化学计量点时易沉淀的问题不能保证足够的流动性聚阳离子过量又会产生毒副作用.本文中利用聚赖氨酸与聚乙二醇的三嵌段共聚物与DNA结合,由于形成的复合物的外面包裹PEG ,即使在化学计量点时也不会产生沉淀.1实验部分1.1主要试剂PLI(Z)-PEG-PLI(Z按文献9]合成.胰蛋白酶Trypsin):E0C0311武汉亚法生物技术公司;Dnase [ Deoxyribonuclease I ) :Code D2210 ,TaKaRa 33 %溴化氢乙酸溶液,ACROS Co.质粒DNA :FGgH- FGgH(5.5 kb )按文献10抽提.1.2 主要仪器红外光谱用Perkin - Elmer Spectrum one型红外光谱分析仪(美国) ,KBr压片. 'HNMR测试采用美国Varian公司INOVA-600型核磁共振光谱仪,以重水为溶剂.荧光光谱采用ShimadzuDATARecorderDR-3型荧光光谱仪激发波长为527nm发射波长为585nm.紫外光谱采用PekinEImerλ-17型紫外可见光谱仪.测量波长为260nm时对应的OD值.TEM测试采用H-7000FA(HTTACH)型透射电子显微镜TEM )加速电压为80kV .制样时先在铜网上敷-层富尔膜再在膜上喷涂碳膜轻轻滴一滴样品溶液迅速吸干真空干燥后进行TEM测试原子力显微镜将一点样品轻轻滴加到玻璃上,自然风干然后在NS3a型原子显微镜下观察.凝胶成像系统:U中国煤化工.激光共聚焦显微镜:LEICA公司TCS SP2型.TYCNMHG收稿日期2004-06- 12.基金项目湖北省高分子材料重点实验室基金作者简介杨子刚1977- )男 硕士程时远通讯联系人E - mail scheng@ publie . wh. hb. cn第4期杨子刚等聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与DNA聚离子复合物胶束的研究3231.3实验步骤1.3.1 聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸PLL- PEG- PLL )的合成 向一 定量的聚( Ne -苄氧羰基赖氨酸)-聚乙二醇-聚(Ne-苄氧羰基赖氨酸)中加入33%的溴化氢的乙酸溶液,10min后变为透明的溶液继续反应又慢慢变浑浊50 min后停止反应.将反应液倒入-定量的无水乙醇中沉淀,过滤再用无水甲醇溶解再用无水乙醇沉淀过滤真空室温抽干.1.3.2 聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与DNA聚离子复合物胶束的制备 聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸和DNA分别用pH7.4的Tris - HCl缓冲溶液配制成一定浓度的溶液 聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸所带正电荷按照其中赖氨酸的聚合度与物质的量的乘积计算,DNA所带的负电荷由其中碱基的个数与DNA物质的量的乘积计算,因为碱基与DNA分子中提供负电荷的磷酸基团的数目是-致的.然后配制成-系列不同电荷比的复合物在所有的实验中DNA的最终浓度都控制为15mg/L.用于聚离子复合物大小和形态的研究.1.3.3 聚离子复合物胶束的荧光分析 将溴化乙锭按照EB: DNA的质量比1:5加入到聚离子复合物胶束中避光放置12 h然后用荧光光谱仪进行测试.1.3.4 聚离子复合物胶束对脱氧核糖核酸酶I的抗性按下列配方进行酶切实验:脱氧核糖核酸酶Ibuffer2μuL聚离子复合物胶束10山脱氧核糖核酸酶0.2山用双蒸水加到总体积为20山25°C酶切80min后80 C水浴加热使脱氧核糖核酸酶失活然后加入40μL1 %的胰蛋白酶瞬时离心后置于37 C水浴中30 min再加入60 puL异戊醇/氯仿1:24 V/V )溶液.12000 r/min离心5 min取上层液加入3pμL3mol/L乙酸钠溶液,100μxL无水乙醇AC放置40min.12000r/min离心10min去掉液体,37C恒温烘干再加入20p山Tris-HCl溶液电泳观察用凝胶成像系统拍照.1.3.5转染实验使用无抗生素的培养基培养细胞待细胞密度达到90%~95%在100puL无血清的SFM培养基中加入10yuL的DNA形成SolutionA另100pμ无血清的SFM培养基中加入100pμ的嵌段共聚物形成Solution B分别轻轻混匀将溶液A和B混合后.27 °C温育30~45 min然后补加800 pu山的SFM将上述1mL混合液加入到细胞培养平板(己用2mL无血清培养基洗过一次)中使分布均匀27C培养4~6h后吸去以上加入的1 mL混合液再加入3 mL完全培养基(含血清)培养72 h后用激光共聚焦显微镜观察.2结果与讨论2.1聚赖氨酸-聚乙二醇-赖氨酸的制备聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸按schemel步骤由聚(N∈-苄氧羰基赖氨酸)-聚乙二醇-聚( N-苄氧羰基赖氨酸)氨基去保护生成,去保护是在33 %的溴化氢的乙酸溶液中进行的同时反应条件要求无水无氧.从红外光谱图,1 705 cm-l处没有羰基的特征吸收峰,从而证明苄氧羰基的去除.图1是聚合物的'HNMR化学位移的归属为3.62 - CH2-CH2-0- ),3.08( δ-CH2 ),1.62~1.71( (CH2)- )未见有苯环上质子的化学位移，从而可以确定苄氧羰基已经完全除去.另外有3.62 - CH- -CH2-o- )3.08( δ- - CH2 )对 应的积分值计算出聚合物的组成结果聚合度没有变化,由此可见在去保护过程中不会发生聚合物链的断裂.H( NHCHOC )，NHCH2CH( 0CH2CH2 )mOCH2CH2NH( COCHNH ),HR33 % HBCHgCOOHH( NHCHOC ) NHCH2CH( 0CH2CH2 )0CHLCHNH_ COCHNH ),H中国煤化工MHCNMHGR =( CH2 2NHC00CH2-R2 =( CH2 )NH2Schemel聚赖氨酸 -聚乙二醇-聚赖氨酸的合成路线324湖北大学学报(自然科学版)第26卷2.2嵌段共聚物胶束介 导基因传递的一般过程在生理条件下,DNA是带负电荷的柔性大分子没有外力或载体的作用是很难穿过细胞膜进入细胞的当嵌段共聚物的阳离子部分与带负电的DNA分子形成聚离子复合物胶束( polyion complex micelle )后其尺寸明显减小可以通过细胞内吞或吞噬作用进入细胞在细胞内紧密的复合物可以保护DNA避免核酸酶的降解.图2是聚离子复合物胶束介导的基因传递的一般过程.在DNA进入细胞之前,DNA与嵌段共聚物首先复合形成紧密的聚离子复合物胶束聚离子复合物胶束通过胞吞途径进入细胞质在其中会与内体、溶酶体结合，通常情况下内体和溶酶体的pH值( pH值为5.5 )和酶-般会导致进入其中的DNA的降解但是pH5~ 7范围内具有较高缓冲能力的聚阳离子能够与内体中质子结合导致内体的渗透压升高,内体的膜更容易破裂聚离子复合物胶束会从内体逃逸.聚离子复合物胶束从内体中逃逸进入细胞质在细胞质中扩散到细胞核的模上然后进入细胞核在那里DNA转录成RNA后翻译成蛋白质行使功能.2.3 DNA 浓度的测定先将抽提 出的质粒DNA用Tris - HCI缓冲溶液稀释再用紫外分光光度计测出波长为260 nm时的吸收值然后按照1 0D260 = 50 mg/L双链DNA的比例计算出DNA的浓度.2.4聚赖氨酸- 聚乙二醇-聚赖氨酸对DNA的包覆本文讨论 了聚合物1( PLL20- PEG - PLL20 )和聚合物2X PL12 - PEG- PLL12 )对质粒DNA FGgH - FGgH的包覆能力包覆结果通过溴乙锭( ethidium bromide ,EB )的荧光强度来检测.不图3是同电荷配比的聚合物/DNA/EB体系的荧光光谱图纵坐标为相对于DNA/EB体系的荧光强度横坐标为电荷比.当向DNA/EB体系中逐渐加入聚合物时随着电荷比的增加荧光强度先急剧减小然后达到一恒定值.这3.5 2.5~ 15是因为EB是一种阳离子荧光染料能够强烈而又特异性地与双螺旋的DNA相互作用当EB分子的菲啶环插入到DNA54的双螺旋碱基对之间阻止了溶液中水分子通过质子转移而图1 PLL- PEG - PLL的核磁共振谱使激发态EB分子的能量损失，从而EB的荧光强度很大.当向体系中逐渐加入聚合物时,带正电荷的聚合物与DNA结UptakeEndoeytosis合将EB置换出来. 然而,在Tris- HCI缓冲溶液中激发态的EB经过-个非辐射衰减过程这时激发态EB的一个氨基E'scape质子被转移给溶剂，从而导致其荧光强度下降.; Endoneoine以上实验结果说明了聚合物能够包覆DNA形成聚离子Disociation复合物胶束:DNA 与PLL通过静电作用形成核PEG包裹在Nuclear Entry其外面外观上聚离子复合物胶束为均相体系即使在化学计量点也不会沉淀保持着很好的流动性和稳定性.同时比较图图2基因传递示意图3中的2条曲线,可以看出对于聚合物1 ,达到荧光值稳定的电荷比趣100为1.1;对于聚合物28C照8(则为1.3 ,这是由于部60分正电荷包裹在里面不健40能有效的与DNA结合中国煤化工的缘故.从曲线还可以愁20MYHCNMHG看出:随着PLL段的增0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.0 0.51.01.52.0253.0加即阳离子段的增加，聚合物1与DNA的电荷值聚合物2勺DNA的电荷值对DNA的包覆效果要图3电荷比对 EB荧光强度的影响好一些.第4期杨子刚等聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与DNA聚离子复合物胶束的研究3252.5聚离子复 合物胶束对核酶的抗性图4是电泳后用凝胶成像拍摄的照片，从左到右第1道为聚合物2与DNA复合物.经核酶处理后的电泳带第2道为聚合物1与DNA复合物经核酶处理后电泳带;DNA经核酶处理后的情况如第3道第4道为没有用核酶处理的DNA;第5和第6道分别是化学计量比时聚合物1/DNA和聚合物2/DNA未经核酶处理的情况.从图可以看出用聚合物包覆的DNA经核酶处理后带的强度与纯DNA基本相同,说明DNA的浓度基本没变聚离子复合物胶束对核酶有很好的抗性(带1、2) ,而没有用聚合物包覆的DNA则完全降图4 DNA 的电泳图.解了(带3).化学计量比的聚离子复合物因为静电荷为零在电泳条件下不会发生移动,另外由于其中的DNA被聚合物包覆,EB不能插入DNA的碱基对之间,因此电泳时不会显示出DNA对应的电泳带.2.6 聚离子复合物胶束形态、大小图5是聚合物1与DNA形成的聚离子复合物胶束的原子力显微镜图片从图可以看出:聚离子复合物胶束呈球形其大小为10~ 35 nm.图6是同一聚离子复合物胶束未经染色的透射电镜的照片,图7是经过图5聚离子 复合物胶束的AFM2.0 %的乙酸铀染色的电镜照片,从上述两图可以看出聚离子复合物胶束主要呈球形其中有少量的椭球形大小也在10~ 35 mm之间与原子力图片一致;另外图7中球形离子的核部分要比外围部分颜色较深这是因为乙酸铀是DNA的染色剂,而对聚合物不染色,DNA经乙酸铀染色后颜色加深所以出现上述情况.同时可以证明DNA是被聚合物包裹在里面的.形成的聚离子复合物大小很好地满足了用于基因治疗的载体在人体中流动的需要11].图6聚离子 复合物胶束的TEM图7聚离子复合物胶束的TEM图8转染后的激光共聚焦显微镜图片( x50000未染色)( x 100000 2.0 %乙酸油染色pH4.5)2.7转染实验图8是聚合物1与DNA形成的聚离子复合物胶束转染昆虫细胞系SF9后用激光共聚焦显微镜拍摄到的图像.从图中可以看出:聚离子复合物胶束能够介导DNA的传递并且使DNA在生物体中表达出相应的蛋白质图中出现绿色这与我们使用的DNA有关因为我们使用的DNA中含有绿色荧光蛋白(GFP)基因,它表达出蛋白质具有荧光效应YH中国煤化工现绿1色.因而说明DNA能够在生物体中表达生成相应的蛋白质.同时证明形成CNMHGA的活性没有影响其中的DNA是具有生物活性的.3结论PLL- PEG- PLL与DNA形成的聚离子复合物胶束满足了基因传递的基本条件聚离子复合物胶束326湖北大学学报(自然科学版)第26卷使得DNA具有较强的核酶抗性，大小在10~ 35 nm之间呈球形聚离子复合物胶束能够用于基因的传递使基因在昆虫细胞系SF9中能够表达出蛋白质.参考文献:[ 1 ]Maureen D B Andreas G s , ljeoma F U. 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School of Life Science , Hubei University , Wuhan 430062 China)Abstract PLL - PEG - PLL were obtained by deprotetion of amino of PLI( z)- PEG- PLI( z). The proper-ties of polyion complex micelle ( PIC ) which consists of PLL- PEG- PLL and DNA were investigated. It showed :PLL- PEG- PLL could condense DNA , larger PLL were generally more effective at condensation ; the system is ho-mogenous and can not precipitate even under charge - neurtralized condition. Remarkable increase in the nucleaseresistance of DNA through the incorporation into the core of PIC ;PIC were spherical , the size were 10~ 35 nm. PICcan apply to gene delivery and the DNA can express in the cell line SF9 .Key words :poly( L - lysine ) ipoly( ethylene glycol ) ;block copolymer ; DNA ; polyion complex miell( PIC )(责任编辑游俊)中国煤化工MHCNMHG