RP-HPLC法测定发酵液中β-苯乙醇的研究

食Science and Technology of Food Industry分析检测RP-HPLc法测定发酵液中β-苯乙醇的研究刘东亚,金征宇(江南大学食品学院,江苏无锡214036)讀要:运用反相高效液相色语对发酵液中的β-苯乙磚进行定1材料与方法性定量分析确定了RP-HPLC测定发酵液中β-苯乙醇1.1材料与仪器的含量的方法。色谱柱 Dikma Diamonsil C(150mmx46mm,5μm, Waters),流动相:甲醇:水=40:60(w/v),流速B-苯乙醇标准品 sigma;L-苯丙氨酸医药1.0mL/min,紫外检测波长:26nm,拄温:30℃,外标法定量。结果:RP-HPLC法测定浓度在42)μL/10m时级,江苏无锡晶海氨基酸股份有限公司;甲醇色谱性关系良好,r=0.9998,平均加样回收率为9771%,RSD纯,江苏汉邦科技有限公司;超纯水自制。为1.04%(n=5)。此方法准确,灵敏,简单,重现性好,适合于发酵液这种复杂体系中β-苯乙醇的定量分析UV-1201紫外可见分光光度计北京瑞利分析美键词:β-乙酹,发酵液,反相高效液相色谱法仪器公司; Agilent I100高效液相色谱仪系列包括中图分类号:T20l.1文献标识码:A四元泵、DAD检测器、自动进样器和色谱工作站;电文章编号:1002-0306(2006)01-0198-03子大平 METTLER TOLEDO,AB104-NMAx101g,d=0.1ng;045μm微孔滤膜上海兴亚净化材料厂台式离心机TDI-5上海安亭科学仪器厂。β-苯醇(阝-PE)是一种有着浓郁的玫瑰香味12实验方法的醇,玫瑰香料的广泛需求使得阝-PE成为香料和化1.2.1色谱分析条件色谱柱: Dikma Diamonsil C1s于很多花和植物,如玫瑰、风信子、莉、水仙、百合(40:60/v);流速:lmL/min;柱温:30℃;进样量等的精油中,玫瑰精油中β-PE的含量较高,最高可10uL;检测波长:260nm达60%,高浓度的产品只有用溶剂抽提才可生产出122溶液的制爷来,但损失很大,提取价格昂赀。欧美食品立法机构1.2.2.1标准品溶液精确量取0.1mLB-苯乙醇标把用物理法、酶法或是微生物法处理自然资源生产准品,用甲醇溶解,定容至10mL,配成浓度为出来的香味成分定义为天然香料。酵母的 Ehrlich代谢途径屮,通过把L-举丙氨酸生物转化为2-PE是100μL/10mL的贮备液,分别吸取贮备液0.0、0.4、种很好的生产天然β-苯乙醇的方法在B-苯乙醇产0.8、1.2、1.6、20nmL以甲醇定容至10mL,得0、4、8、12、16、20μL/10mL的标准液,经0.45μm微孔滤膜过生菌的菌种选育和发酵工艺研究过程屮,需要建立滤后,滤液用于HPLC测定种对β-苯乙醇组分和含量的快速检测方法。日1.2.22发酵液样品溶液β-苯乙醇发酵液以前,报道的检测方法有GC法、HPLC法,国内该方4000r/min离心15min,去除菌体,取上清液用面研究目前尚无相关报道。本文利用反相高效液相色谱法对发酵液中β-苯乙醇的定量测定进行了研0.45μm过滤,即得待测样品溶液究,狄得了较为满意的结果可作为β-苯乙醇的定量1.2.3檢测波长的确定将β-苯乙醇标准品溶解于测定方法。甲醇中,制备成浓度约20μL/0mL的溶液,在200400r中国煤化工全波扫描,-米乙醇在2峰,实验中以218nm收稿日期:2005-03-1为CNMHG时色谱图基线平稳、作者简介:刘东亚(1981-),男,在读硕士研究生,研究方向:生物技术峰形良好,故选择260m作为检测波长。在食品中的应用。19820第没进博食品灬业纣核分析检测o.27,No.01,2006好,如表1所示(n=5)。1.2.7回收率实验取已知β-PE含量的发酵液315份,向其中分别加入三个浓度水平的B-PE标样,测定加入标样后的回收率,算得平均加样回收率为9771%,符合测试要求,如表2所示01.2.8发酵液样品测定1.2.8.1发酵液的预处理β-PE发酵液以4000r/min波长(nm)离心15min,去除菌体,取上清液用045μm过滤,即图1得待测样品溶液。124流动相和流速的确定文献中采用乙腈-水以1.2.8.2标样及样品的分离色谱图在上述优化的相关配比作为流动相。考虑到乙腈价格较高,同时参色谱条件下,标准品和样品溶液得到充分的洗脱和考其他文献,分别配制不同组成的流动相进行实验,分离,保留时间分别为7207和7220min,色谱图见经过多次筛选,结果表明,甲醇-水(40:60,vV)的系统图3图4。从图中可知,在本色谱条件下,发酵液中效果最好。同时,对不同流速(O80、100、120mL/min)条的β-PE能得到很好的分离,保留时间与标准品基本件下的分离情况进行研究。与1.00 ml min相比较,流致,峰形对称且无明显的干扰峰。速为0.80mL/min时保留时间增加,分离效果较差;流速为L20ml/min时保留时间缩短,但不明显,且分离效果与1.00nL/min相差不大。考虑到柱压的因素,最终选用流速为100m/min1.2.5标准曲线的绘制按22中所配0、4、8、121620μI/lOm的标准液,经045μm微孔滤膜过滤后,在上述优化的色谱条件下进样10μL测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标作标准曲线,结果见图2。线性回归方程为y=23902x-13188,r=09998。结果表明,B-苯乙醇在4-20L10mL范围内线性关系良好。图3标准品色谱图标样浓度(μL/10m0图2阝-苯乙醇标准曲线57.51012.5126精密度实验取浓度1.28mL/I左右的发酵液样品,在前述色谱条件下连续进样5次,考察方图4发酵液样品色谱图法的重现性。算得相对标准偏差为1.04%,精密度良1.2.8.3发酵样品測定结果如表3。表1精密度实验(n=5)测定值mL1)纽分平均值mL/LRs%1.30741.28311.28451.26631,27761.2838表2加样回收率实验原样浓度(mLL)添加浓度(mL/L)测定浓度(0.YH中国煤化工—平均叫收率常CNMHG2.3921.6000L.172006年第01期食业技分祈检测Science and Technology of Food Industry表3发酵样品测定结果中的味强化肽食品与发酵工业,2004.30090:96-99样品5]赵光辉,王成福,李俊萍采用反相高效液相色谱法测定木测定结果(mD080.720.361190.94糖醇产品中各组分含量食品与发酵工业,2004,300:1172讨论16] MM W Etschmann, D Sell Schrader. Biotechnological本文建立了一种 RP-HPLO法测定发酵液中B- production of2- phenylethanol[Jl. Appl Microbiol BiotechnolPE的分析方法,流动相为甲醇:水(40:60,v/v);色谱柱2002591-8.e Dikma Diamonsil Cig(150mm x4.6mm, Sum, Waters), [71 Christoph wittmann, Michael Hans, Wilfried Bluemke.流速1ml/min,最适吸收波长260mm。此方法具有处 Metabolic physiology of aroma-producing Kluyveromyces理简单、快速、定量准确、回收率高和重复性好的特 marxianus[J]. Yeast,200.19:1351-1363点。在β-PE产生菌的菌种选育和发酵工艺研究中采e Cheng-Chun Cho用本法,可有效的对菌株生产能力和发酵条件进行Production of 2-phenylethanol, a flavor ingredient, by Pichia评价,为菌株改良,发酵与分离工艺的优化,提高单fermentens L-5 under various culture conditions]. Food位发酵液的目标产率和分离提取的收率提供了有效 Research International20034277-282的分析分离手段9 D Stark, T Munch, B Sonnleitner I W Marison, U vonstockar. Extractive Bioconversion of 2-phenylethanol from L参考文献Phenylalanine by Saccharomyces cererisiae [. Biotechnol Prog.[]达世禄色谱学导论M武昌:武汉大学出版社1999320)-3392002,18:514-5232]孙宝国,等香料与香精M北京:中国石化出版社20091010MMW. Etscbmann,Dse, Schrader. 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