循环水根系分泌物收集技术的研究及应用

第25卷第6期北京林业大学学报Vol 25. No 600年11月JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY循环水根系分泌物收集技术的研究及应用贾黎明冯菊芬文学军孙焱北京林业大学资源与环境学院)(山东省滥博市园林管理处)摘要该文作者于200年设计并应用循环水根系分泌物收集装置,结合D061型树脂柱收集了纯栽和混栽条件下杨树与刺槐氨基酸类N素根系分泌物,并对其物质形态进行了初步研究结果表明:循环水根系分泌物收集装置够正常运转,真正实现了在现实栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准确收集和研究根系分泌物仅仅7d时间即可收集到根系分泌物中的多种氨基酸,并达到可检出的量精氨酸和甘氨酸是纯栽刺槐根系分泌物中的主要氨基酸,占游离氨基酸总量的432%;而精氨酸和赖氨酸是纯裁杨树以及混裁苗木根系分泌物中的主要氨基酸循环水根系分泌物收集技术为根系分泌物的深入研究提供了方法上的保障关键词根系分泌物,收集装置,杨树,刺槐,混交林,种间关系中图分类号S71843Jia Liming; Feng Jufen; Wen Xuejun; Sun Yan. Cycling-water collection technique on root exudates andits application. Journal of Beiying Forestry University( 2003)25(6)6-10 [ Ch, 9 ref. School of Resourcesand Environment, Beijing For. Univ, 100083, P R ChinaAmino acids in nitrogen root exudates of pure and mixed planted black locust and poplar seedlings werecollected and identified by the designed cycling-water collection device of root exudates and Do61 ion-exchange-resin in this paper. It shows that: the cycling-water collection device of root exudates could be operatednormally. The certain amounts of root exudates are enriched in the device that makes the materials collectionsuccessful without damaging the roots in time and continuously as well. Only by geven days, many kinds ofamino acids in nitrogen oot exudates were collected and detected quantitatively. Arginine and glycin were themain kinds of amino acids in root exudates of pure planted black locust seedlings and reached 43. 2% in disgo-ative amino acids. Arginine and lysine were the main kinds of amino acids in root exudates of pure plantedpoplar seedlings and mixed planted poplar and black locust seedlings. It is concluded that the cycling-watercollection technique is much better than other methods to conduct the study on root exudatesKey words root exudates, collection device, poplar, black locust, mixed forest, interspecific relationship我国对混交群落树种间关系的研究经历了约主导作用的是养分关系这种关系不仅表现为对土50年,从对树种间关系现象的简单描述逐步上升到壤的改良,而且也表现为树种间N、P养分的互补转对树种间关系机理的深入研究上,取得了一大批研移,即通过根际微区杨树可以转移磷给刺槐而刺槐究成果.尤其是进入20世纪90年代,在国家自然科可将固定的氮转移给杨树2,这种转移主要通过根学基金的多次重点资助下,对树种间相互作用机制系的相互接触来完成.本文则欲通过研究两树种的了解越来越深入,在化感作用、以养分关系为主的的根系分泌物组成,进一步探索两树种养分转移的生理生态相互作用机制等多方面都取得了重要突物质形态,从而为揭示树种间养分转移的生态学意破这一时期,北京林业大学“混交林及树种间相义奠定基础,并为今后的研究进行方法上的探索互作用机制”课题组以杨树、刺槐混交林为模式群落对根系分泌物的研究是植物营养、化感作用、根对树种间相互作用机制进行了深入研究.前期研究际微生态研究的重要内容,受到国内外的普遍重视发现,在杨树刺槐混交林树种间复杂相互关系中起因为植物根分泌物不仅是根-土界面的润湿剂、微2003-04-16收稿中国煤化工http://国家自然科学基金重点项目(39230280)和国家自然科学基金项目(39870643CNMHG第一作者:贾孳明,男,1968年生,博士,副教授主要研究方向:森林培育、城市林业电话:010-62338194E-mil:jm@b,,cm地址;10003北京林业大学资源与环境学院第6期贾黎明等:循环水根系分泌物收集技术的研究及应用生物的能源物质,更重要的是植物营养效率基因型定期喷酒福尔马林溶液灭菌;配制好的 Hoagland全差异的标记物及植物间相互作用的纽带根系分泌背养液高温高压灭菌(温度121℃,压力0.1MPa条物的收集、分离和鉴定是一个国际性的难题尤其是件下,灭菌1个h);培养基质处理和灭菌:将粗沙、如何能够收集到足够量不受微生物污染的根系原始鹅卵石、玻璃棉放在稀释浓度为01%~02%的盐分泌物更为困难目前根系分泌物的收集方法主要酸中浸泡一昼夜,第2天用自来水冲洗至pH值为有出土根系淋洗法、营养液培养法、沙培法、琼脂固7,然后将它们高温高压灭菌(条件同上).自然冷却定定位培养收集法等根系淋洗法不可取,因是后作为栽培基质;将盆栽容器、乳胶管玻璃器皿浸泡将根系挖出后淋洗,根系已受损伤收集的根系分泌于稀释浓度为015%福尔马林溶液中1昼夜灭菌物中更多的是根系本身的内含物和伤流液;营养液1.4收集根系分泌物中氨基酸类N素物质树脂和培养法则使根系基本处于一个厌氧环境,收集的根处理系分泌物不能代表正常生长状态的情况;如解决了树脂:购自南开大学树脂厂的D061大孔强酸性微生物的影响,沙培法和琼脂固定定位培养法是当苯乙烯系阳离子交换树脂前效果较好的根系分泌物收集法,因其基本上能代树脂的预处理:树脂从厂家购入时含有杂质,且表植物的自然生长状态本文通过总结前人的经验,全部为钠型,需将树脂转化为氢型,以便与氨基酸进在借鉴国外研究"的基础上,设计并应用循环水根行离子交换处理方案如下:树脂先用去离子水浸泡系分泌物收集装置配合离子交换树脂,对刺槐1-24,除去杂质;用2倍于树脂体积的2 mol/L HCI( Robinia pseudoacacia)、群众杨(小美旱)( Populus[ P常温下不断搅拌30min,然后用去离子水洗至中性ini×(P, pyramidalis+ Salix matsudana)])根系分再用2倍于树脂体积的2 mol/L NaOH常温下搅拌泌物中氨基酸类N素物质进行了实时收集,并进行30min,然后再用去离子水洗至中性将上一步骤再了分离鉴定重复一遍,然后用2 mol/L. HCL搅拌30min,用去离1试验材料和方法子水洗至中性,待用树脂柱的制备:采用湿法装柱层析柱中先加入1.1试验设置少量去离子水,取适量处理好的树脂用去离子水浸时间、地点:2000年6月,盆栽试验设在北京林湿后,装入层析柱,注意装柱时勿使柱内有气泡,最业大学苗圃生物中心温室植物材料:群众杨(小美旱)当年扦插苗,刺槐l后使液面与柱内树脂面相切,使树脂保持湿润接人装置.年生实生苗1.5根系分泌物收集盆栽容器:去底5L的方形塑料桶(规格15cm缓苗期过后(约20d),用蒸馏水将系统中残存15cmx32cm),倒置.配置方式:3处理3重复,3处理为纯栽刺槐(每的营养液和根系分泌物喷淋冲洗,直到没有茚三酮盆3株);纯裁杨树(每盆2株);混裁(每盆2株刺槐显色反应为止,目的是去除缓苗期间的根系分泌物将选择的最佳树脂柱接入循环水根系分泌物收集装1株杨树)栽植:选择根系较发达的1年生刺槐苗(根系有置采用去离子水循环接柱连续收集7d后,用洗脱根瘤)根系进行适当修剪后用015%的富尔马林液洗脱树脂柱,洗脱分两步进行:第一步用pH=6.6溶液表面灭菌,栽植于容器中;早期在无菌土上扦插0.38m0柠檬酸一柠檬酸三钠缓冲溶液洗脱碱的杨树苗木移入容器性氦基酸;第二步用pH=8的0.2mol/LNa2HPO4栽培基质:粗沙鹅卵石、玻璃棉;以 Hoagland全0.1mo/L柠檬酸缓冲溶液洗脱中性和酸性氨基酸营养液为培养液然后用“旋转蒸发器”对洗脱下来的根系分泌物进行1.2循环水根系分泌物收集装置所需材料浓缩将浓缩后的根系分泌物样品送中国林业科学容器:去底5L的方形塑料桶(规格15cm×15院森林生态环境研究所有机分析室,利用氨基酸自ⅹ32cm),倒置;小型空气压缩机:功率35W;橡动分析仪进行样品分析皮塞:大小以可塞严容器口为准,且橡皮塞中部打孔塞入玻璃管;乳胶管;直玻璃管若干;T型管;Y2结中国煤化工型管;小漏斗;特制带方孔木桌;树脂柱:层析柱,规2.1CNMH格为10mmx200mm在前八对切例、树骰水丌划收集研究的基1.3灭菌处理础上,为了能真正实现在现实栽培条件下无损根培养室为封闭玻璃小温室,内设紫外灯消毒,并系、实时、连续、富集、定量、准确收集和研究根系分北京林业大学学报第25卷泌物,专门设计并制作了“循环水根系分泌物收集装棉然后铺一层鹅卵石,起到密封的作用,可阻止或置(图1)减少空气中微生物向循环系统中侵人(3)空气压缩机进气口连接一小漏斗,小漏斗中塞入经灭菌处理的玻璃棉,防止空气中的灰尘进入机体,延长空气压缩机的工作寿命,同时也阻止或减少空气中的细菌进入循环装置(4)循环装置中“T”型玻璃接口的导气口应调整在回水口的下方,气流才能顺利使下水口流出的循环液回流到栽培容器中;同时气流在“T”型玻璃接口下水口处产生负压,可促使树脂柱中的循环液下流,从而利于整个循环系统循环液的正常流动(5)回水管要相对较长,利于来回调整回流液回流于栽培容器中的位置(调整回水位置,可使回流液在各个方向均匀向下淋洗根系分泌物)10(6)循环液(培养液或去离子水)要适时适量注入,注入量太少会影响循环系统的正常循环,注入量过多,会使苗木根系长时间浸泡处于无氧呼吸状态可能致使苗木死亡,培养液的无节制加入会出现苗木营养过剩,导致苗木的高生长过度,而影响苗木的1栽培容器;2盆栽苗木;3鹅卵石;4玻璃棉;5粗沙子;6橡皮径生长,因此培养液可隔一段时间(如:1周)加1塞;7玻璃管;8下水管;9树脂柱;10树脂;1砂心;12止水钳:13“T型玻璃接口;14回水管;15“y“型玻璃接口;16导气次,其它时间用灭菌去离子水管;17小型空气压编机;18小玻璃漏斗(7)正式收集前,即循环装置未安装树脂柱之图1循环水根系分泌物收集装置结构前,循环液流速不需控制,只要保证其正常循环即可安装树脂柱之后,不但要保证循环液的正常循of root exudates环,同时需要通过止水钳调节循环液的流速,使其保其工作原理是苗木栽植后,向容器中注入适量持在5mmin,这样才能使根系分泌物中的N素物培养液,培养液向下渗流的过程中将根系分泌物向质与树脂充分进行交换;如果循环液流速过快,交换下淋洗,小型空气压缩机能够长时间不间断工作,其吸附还来不及进行,根系分泌物又被回流到栽培容吹出的气流通过乳胶管(导气管)到达下水口时,在器中,达不到交换吸附的目的此产生负压,可使培养液通过乳胶管(导气管和回流8)正式进行根系分泌物N素物质的收集时,管)将自栽培容器中下流的培养液回到栽培容器,形为了能使循环液充分淋洗栽培容器各个部位的根系成又一次下渗淋洗,循环回路形成在培养液下水口分泌物N素物质,我们将回流液蓄积于小喷壶中,接入选择性吸附树脂柱,根系分泌物中的物质会被达一定量时用人工向栽培容器中均匀喷洒树脂柱不断富集经过长时间的试验证实这一装置22收集根系氨基酸类N素分泌物的影响因素能够正常运转,并能在根系分泌物研究中发挥很好2.2.1 hoagland营养液对收集根系氮基酸类N素的作用分泌物的影响为保证循环装置正常工作,使树脂柱能成功富Hoagland营养液中含有大量的K'、Na、Ca2等集根系分泌物,我们在实践中总结得出一些经验:金属阳离子这些金属阳离子与树脂的离子交换能(1)培养室循环装置的各组件均需灭菌处理,力远大于根系分泌物中N素有机物质与树脂的离使循环系统内部尽可能的在无菌条件下运转,以防子交换能力试验表明,用2mL营养液过柱后,其中止大量微生物的侵入使根系分泌物中的N素物质的Ca2'被树脂100%离子交换;用营养液湿法装柱变性,致使试验收集的并非真正的根系分泌物.比用蒸Ⅵ凵中国煤化工基酸的量减少(2)容器最底层垫一层玻璃棉玻璃棉上再铺43%;用CNMHG+丙氨酸+赖层鹅卵石,可阻止粗沙子被循环液淋洗进入玻璃氨酸标准溶液,其最大离于父秧量减少74%试验管、乳胶管,致使循环受阻;其上放入栽培基质中还发现,在采用循环水收集根系氨基酸类N素分粗河沙将苗木栽培好后,再在粗沙上铺一层玻璃泌物过程中,收集1h后,取过柱前的循环液比色呈第6期贾黎明等;循环水根系分泌物收集技术的研究及应用无色,但过柱后比色却呈微紫或淡紫色这是因为过外,又在洗脱后的流出液中加10%醋酸铅,生成白柱前循环液中的氨基酸含量较低,且浓度较小,所以色沉淀后将其过滤,此操作重复5~6次,直至不再比色时会呈无色,而循环液过柱后树脂除了离子交产生白色沉淀,证明鞣酸全部除去换营养液中的金属阳离子外,也能离子交换氨基酸,2.3混栽杨树、剩槐根系N素分泌物分析但由于树脂离子交换金属阳离子的能力优于氨基酸,所以被富集在柱子上的氨基酸又被取代下来,此表1根系分泌物氨基酸含量时氨基酸的浓度较过柱前高因而比色时显紫色.可Table I The content of amino acids in root exudates见, Hoagland营养液对根系分泌物中氨基酸类N素of black locust and poplar seedlings物质的收集有很大影响,从某种程度上讲,营养液具氨基酸混栽/混栽理论值有洗脱氨基酸的作用.另外,一旦培养液中的金属阳(n周)(周)离子被交换离子交换,循环液将呈酸性,以至苗木根1天门冬氨酸o.17系渗透势发生了变化,苗木会表现出受盐胁迫的萎2苏氨酸0.462001丝氨酸蔫现象(试验开始2个h左右就会有所表现)4谷氨酸0.002为了排除营养液对收集氨基酸类N素根系分5甘氮0.9280010.624泌物的影响,在正式收集根系分泌物时需将营养液6丙氨酸0.3570.242缬氨酸0,163001l0.112全部排放掉,并用蒸馏水少量多次冲洗至没有无机8蛋氮酸离子.前面已经提到,在培养期间为控制苗木营养过9异亮氨酸0.0770.0290.050.061甚需隔一段时间(7d左右)加一次营养液因此在营10亮氨酸0.650.6000.3011酪氨酸0.1940.143177养液培养一段时间后排空营养液(不要超过7d)对12苯丙氨酸0.1210.09000420.1苗木生长没有什么不利影响,在此期问收集氨基酸3组氨酿0.1480.090.2170.125类根系分泌物为好14糗氨酸0.29915精氨酸0.8432.2.2收集时间对根系N素分泌物测定的影响氨基酸总量在预备试验时,利用循环水根系分泌物收集装注:一为痕;混栽理论值=纯槐x2/3+纯杨×13置收集分泌物24h,并用两种洗脱液以最小洗脱量分别对各种氨基酸进行洗脱(即先用3mpH=6.6前期研究中“测定了混槐及纯槐根系分泌物的0.38mL柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液洗脱碱中易被吸收的小分子N素物质结果表明刺槐根性氨基酸,再用8mpH=8的0.2 mol/L N2HPO4-系分泌物中以氨基酸态-N为最多,其次为NH-N,0.1molL柠檬酸缓冲溶液洗脱中性、酸性氨基酸),NO3-N含量较少,面酰氨态N含量极低”,本研究将洗脱后的11mL流出液合并在一起,用旋转蒸发中应用“二缩脲反应”检验发现,在杨树刺槐纯栽和仪在50℃~60℃下浓缩成5叫L,作为根系N素分泌混栽的条件下苗木的根系分泌物中未检测出有多物待测液送中国林科院分析鉴定但因一天内其根肽蛋白质等N素物质因此首先主要以含量最多系氨基酸类N素分泌量太少,用氨基酸自动分析仪的氨基酸态N为对象进行杨树、刺槐N素根系分测定时,前面三种氨基酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨泌物的收集、分析.由表1可以看出,收集7d纯槐酸)出现一馒头峰无法分开所以再次试验时将时的根系N素分泌物中精氨酸和甘氨酸含量较高占间延长至7d并用去离子水进行循环以收集根系游离氨基酸总量的432%;纯杨的根系N素分泌物分泌物,结果表明根系分泌物中氨基酸类物质的量明中赖氨酸和精氨酸含量较高,占游离氨基酸总量的显加大,达到了可以检出的水平(下面将详细讨论)66.0%;混栽刺槐、杨树根系N素分泌量中精氨酸和2.2.3根系分泌物中鞣酸对收集N素物质的影响赖氨酸含量较高,占游离氨基酸总量的78.8%.将在收集根系N素分泌物时发现,树脂柱上明显每一处理的根系分泌物折算到单株上,则纯栽刺槐富集一些白色物质,而且洗脱后的流出液比色时产氨基酸分泌总量为1.543wg/(周·株),纯栽杨树氨生大量的白色沉淀物质,用醋酸铅鉴定是鞣酸物质基酸分泌总量为0715g/(周·株),混栽苗木氨基在起作用为了排除其可能造成的干扰,一方面我们酸分泌中国煤化工,纯槐单株根在接柱收集时将树脂柱上加少许玻璃纤维,这样既系N素可以阻挡大分子的鞣酸,也可以防止循环收集时冲分别是CNMHG纯杨和混裁,木根系N素分动树脂;另一方面,在洗脱前用蒸馏水多次冲泌物相对总量明显低于纯槐,而栽培装置是全封闭柱这两种方法均能除去大部分鞣酸和其它杂质另那么混栽中刺槐根系分泌的氨基酸为何减少?有苗10北京林业人学学报第25卷木根系生物量不同的可能因素,更可能的是盆栽中长如何解决延长收集时间与为苗木补充营养间的苗木根系发达导致混栽刺槐与杨树的根系相互交错子盾,需进一步的分析和研究接触刺槐根系分泌中大量的氨基酸通过根系接触(4)精氨酸和甘氨酸是纯栽刺槐根系分泌物中的途径直接转移给杨树假设以纯栽苗木单株分泌的主要氨基酸,而精氨酸和赖氨酸是纯栽杨树以及的每种氨基酸量为标准值按株数折算出混栽苗木的混栽苗木根系分泌物中的主要氨基酸纯栽刺槐单论分泌量则可以获得更多信息,结果表明(表1),株根系氨基酸类N素分泌物总量高出纯栽杨树和混栽苗木根系分泌物中大部分氨基酸和总量的实际混栽苗木的22倍和23倍混栽刺槐单株根系氨值大大小于理论值,其中苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙基酸类N素分泌物含量的减少有可能是杨树吸收氨酸缬氨酸等下降的幅度非常大,但组氨酸和赖氨的结果以纯栽苗木单株分泌的每种氨基酸量为标酸则例外,其实际值要显著高于理论值,说明混栽可准值,按株数折算出混栽苗木的理论分泌量,表明混刺激这两种氨基酸的分泌,至于其生物学意义还需栽苗木根系分泌物中大部分氨基酸和总量的实际值大大小于理论值.其中苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨从利用循环水根系分泌物收集装置7d研究的酸、缬氨酸等下降的幅度非常大,但组氨酸和赖氨酸结果看,循环水根系分泌物收集装置结合D061型树则例外,其实际值要显著高于理论值,说明混栽可刺脂柱对氨基酸类N素根系分泌物的收集是确有成激这两种氨基酸的分泌,至于其生物学意义还需进效的:D061型树脂对氨基酸的交换吸附具有相对广步探讨泛性,循环水根系分泌物收集装置的设计应用为长5)循环水根系分泌物收集装置可广泛用于各时间连续收集根系N素分泌物提供了条件,仅仅一种植物的根系分泌物收集,但收集树脂则需根据所周时间已经收集到多种氨基酸,并已达到可检出的收集的根系分泌物类型不同而不同量但同时也可看出一周收集的结果,各盆栽根系分泌物氨基酸的含量总的来说是非常低的,有些氨基酸含量在分析过程中呈现为痕量,说明收集时间过短,如何解决延长收集时间与为苗木补充营养间的1沈国舫翟明普森林培育学,北京;中国林业出版社,2∞01矛盾,需进一步的分析和研究2沈国舫,贾黎明,翟明普,沙地杨树刺槐人工混交林的改良土壤功能及养分互补关系,林业科学,1998,34(5):12-203结论与建议贾黎明翟明普胡延杰,等,杨树刺槐种间磷素营养关系.见沈国舫主编混交林研究北京:中国林业出版社,1997,50-571)循环水根系分泌物收集装置设计成功能4贾黎明,翟明铧,胡延杰等,杨树刺槐种间氮素养分转移.见够正常运转,真正实现了在现实栽培条件下无损根沈国舫主编混交林研究北京:中国林业出版社,1997.41-49系、实时、连续、富集、定量、准确收集和研究根系分5贺伟贾黎明.混機杨树-刺槐间磷素养分转移途径的研究.应泌物,这为根系分泌物的深入研究提供了方法上的用生态学报,2003,14(4):481-486保障6张福锁.环境胁迫与植物根际营养,北京:中国农业出版社(2)循环水根系分泌物收集装置运转正常和根7陈华君,金幼菊,王沙生,盆裁杨树刺槐根系及其分泌物的生化系氨基酸类根系分泌物成功收集需要注意一些细成分,见:沈国舫主编混交林研究,北京:中国林业出版社节其中消除 Hoagland营养液对收集根系氨基酸类199T,78-87N素分泌物的影响、消除根系分泌物中鞣酸对收集8张彦东王庆成李森友水曲柳落叶松根系分泌物对土壤磷吸N素物质的影响确定恰当的收集时间等非常重要附与解吸的影响.见:沈国舫主编混交林研究北京:中国林业(3)循环水根系分泌物收集装置结合D61型出版社,155-158树脂柱对根系分泌物的收集确有成效,仅仅一周时Tang C S, Young CC. Collection end identification of allelopathic compounds fom the undisturbed root system of Bigalta Limpograss(Hemar间已经收集到多种氨基酸,并已达到可检出的量但thria altissima). Pl Physiot, 1982, 69: 155-160同时也可看出一周收集各盆栽根系分泌物氨基酸的含量总的来说是非常低的,有些氨基酸含量在分析(责任编辑胡涌过程中呈现为痕量,说明收集时间还太短,有必要加中国煤化工CNMHG