聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶的HPLC法测定

中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(11)●1063 ●聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶的HPLC法测定刘英，邵妤，胡海峰*(中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海200040)摘要:建立了分子排阻色谱-高效液相色谱法测定聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶(PEG-1)。 使用凝胶色谱柱，以0.05 molL磷酸缓冲液(pH 7.3) : 甲醇(80 : 20)为流动相，检测波长220 nm。PEG-1在0.2 ~ 1.2 mg/ml范围内线性关系良好。回收率为96.32%，RSD 为1.74%。关键词:聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶:高效液相色谱:测定中图分类号: 0657.72文献标志码: A文章编号: 1001-8255(2014) 1-1063-03Determination of PEGylated Arginine Deiminase by HPLCLIU Ying, SHAO Yu, HU Haifeng*(State Key Lab. of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Instiute of Pharmaceutical Industr,China State Instiute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040)ABSTRACT: A size exclusion chromatography (SEC) -HPLC method was established for the determination of thePEGylated arginine deiminase (PEG-1). A gel column was used with the mobile phase of 0.05 mol/L phosphate buffer(pH 7.3) : methanol (80 : 20) at the detection wavelength of 220 nm. The calibration curve of PEG-1 was linear in therange of0.2- 1.2 mg/ml. The recovery was 96.32%, with RSD of 1.74%.Key Words: PEGylated arginine deiminase; HPLC; determination人体正常细胞和大多数肿瘤细胞均能利用瓜氨治疗药物。其基因已被克隆到大肠杆菌中表达，在酸转化成精氨酸。Sugimura 等证实"，- - 些肿瘤细体外和实验动物中能有效抑制肿瘤细胞的生长。1胞有营养缺陷，不能利用瓜氨酸转化成精氨酸，必的血清半衰期仅几小时，在人体存在较强的免疫原须外源添加精氨酸才能在体外生长。因此，应用精生。美国Polaris Group公司用聚乙二醇修饰1后，氨酸脱亚胺酶(1)耗竭血浆中精氨酸，是靶向治疗血清半衰期延长到7d,现已在进行治疗肝癌的III一些肿瘤疾病的有效方法。期临床试验。Wang等从关节炎型支原体Mycoplasma聚乙二醇化蛋白质的含量测定一般采用Lowryarthritidis中克隆出一种1(2)，其活性在生理pH值法和HPLC法。Lowry法存在易受干扰、反应时间长、下最高，Km值极低，而且不含二硫键，适宜用作某些试剂不稳定等缺点[3]。而HPLC法定量精确、重复性好4。本研究根据中国药典2010年版三部收稿日期: 2014-02-08: 修回日期: 2014-08-22基金项目:国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ15007208)、附录的HPLC法，参照《生物制品质量控制分析方上海市经信委引进技术的消化吸收专题(12X1-09)法验证技术审评- -般原则》以及人用药品注册技术作者简介:刘英(1977-)， 副研究员，硕土生导师，从事药理学研究。要求国际协调会(ICH)Q2(R1)分析方法验证，建Tel: 13801661101立了分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)E- mail: liuyingsipi@163.com通信联系人:胡海峰(1967-)， 研究员，博士生导师，从事微生物测定PEG-1含量。药物研究与开发。1仪器与试药Tel: 021-62892873中国煤化工E-mail: haifenghu88@ 163.comE2695型本心二进样器、柱温箱、MYHCNM HG●1064.中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(11)2489型紫外检测器和Empower3软件(美国Waters公司)。2.64x10, r=0.999。 PEG-1 在0.2~ 1.2 mg/mlPEG-1对照品溶液(浓度1.2 mg/ml,峰面积归- -化法浓度范围内与峰面积线性关系良好。最低定量限测得其纯度为99.17%)和PEG-1溶液(批号20130708-1、(LLOQ)为20 μg/ml。20130708-2. 20130708-3， Lowry 法测得浓度分别为3.9、2.02.5精密度、重复性和回收率试验和2.4 mg/ml)均为自制(5);缓冲体系均为0.05 mol/L磷酸取对照品溶液，连续进样6次，计算得峰面积缓冲液+0.145 mol/L 氯化钠溶液(pH 7.0); 甲醇为色谱纯,的RSD为0.50%。其他试剂均为分析纯。取PEG-1共5份，按“2.1”项下方法处理，2方法与结果分别进样，记录色谱图，计算得峰面积的RSD为2.1供试品溶液配制0.21%。将20130708-1、20130708-2 和20130708-3批向PEG-1中加入相当于80%、100%、120%次的PEG-1分别稀释4、2和2倍后测定。含量的对照品，得到低、中、高浓度的溶液，各32.2色谱条件份，分别进样测定。由回归方程求算待测样品中的色谱柱YMC-Pack Diol-300型凝胶柱(8.0 mmxPEG-1并计算回收率，结果平均回收率为96.32%300 mm, 5 μm);流动相0.05 mol/L磷酸缓冲液(n=9)，RSD为1.74%。(pH 7.3) :甲醇(80 : 20); 流速0.6 ml/min; 检2.6稳定性和耐用性试验测波长220nm;分析时间30min;柱温(30+2)C;取供试品分别于2~8 C和(25+2) C放置柱压(500+10)psi;进样量10 μl.7d，于d1、 2、4、7分别取样，稀释后检测。结果2.3系统适用性试验PEG-1含量的RSD均小于1%，可见1经PEG修PEG-1的相对分子量大于2.5x10',在本试验饰后较稳定。条件下，保留时间约10.3 min,理论板数约1 000,2.7样品测定峰形良好: 1的保留时间约15.5 min; PEG无紫外取供试品，按“2.1”项下方法处理，进样测吸收，不干扰测定。见图1。定。以外标法计算，并折算稀释倍数后，求得3批2.4线性试验PEG-1溶液的含量分别为3.99、2.06 和2.47 mg/ml,取PEG-1对照品溶液，用0.05 mol/L磷酸缓冲分别为Lowry法测定值的102. 18%、102.85%和液(pH 7.3)逐步稀释得到1.2、1.0、 0.75、 0.5 和102.71%。0.2 mg/ml的系列浓度对照品溶液，按“2.2”项下3讨论条件分别进样。以浓度c为横坐标，峰面积A为纵Lowry法检测的是样品中的蛋白质总量，坐标，进行线性回归，得回归方程: A=1.17x10'c-PEG-1中可能存在未修饰的蛋白质;同时，PEG修0.32.AU0.24 I0.24-0.160.0808-0.00-0.08t/min'24-0.08E12 t/min1824 30ABA: PEG-1, B: 1图1 SEC-HPLC 图谱中国煤化工Fig.1 SEC-HPLC ChromatoguMHCNM HG中国医药工业杂志Chinese Joumal of Pharmaceuticals 2014, 45(11)1065●饰可能会影响肽键与试剂的结合，因此不能完全采1992, 2(3): 191-196.信Lowry法测定结果。SEC-HPLC系统中YMC-[2] Wang M, Basu A, Palm T, et al. Engineering an argininecatabolizing bioconjugate: biochemical and pharmacologicalPackDiol-300凝胶柱能够较好地分离相对分子量characterization of PEGylated derivatives of arginine1x10*~ 1x10°的蛋白质，且PEG无紫外吸收，本deiminase from Mycoplasma arhritidis [J]. Bioconjug Chem,法能更准确地检测PEG-1。耐用性考察结果显示，2006, 17(6): 1447-1459.流速、柱温和检测波长在发生小变化的情况下，与[3]张雪梅,郭 桥,吴福泉，等.聚乙二醇化重组干扰索a2b .原条件相比，PEG-1 含量的RSD均小于1%，表明的质量检测[J].中国生物制品学杂志，2005, 18(1): 48-50.本法耐用性良好。[4] 王军志 .生物技术药物研究开发和质量控制[M].2版,北京:科学出版社, 2007: 81-84, 536-539.参考文献:[5] Monstadt GM, Holldorf AW. Arginine deiminase from[1] Sugimura K, Ohno T, Kusuyama T, et al. High sensitivity ofHalobacterium salinarium. Purification and properties [J].human melanoma cell lines to the growth inhibitory activity ofBiochem J, 1991, 273(P3): 739-745.mycoplasmal arginine deiminase in vitro [J]. Melanoma Res,(.上接第1035页)表2不同提取方法样品对EAC小鼠存活期的影响(土s，n=6)[1] 何迅,庞秀清,李勇军,等。多指标综合评分法优选蒲薏Tab.2 Impacts of Samples with Diferent Extraction颗粒提取I艺[].中国现代应用药学, 2012, 29(1): 31-35.Methods on Survival Time of EAC Mice(ts, n=6)[2] 迟明艳,黄 勇，王爱民,等.蒲薏颗粒药效学实验研究[J].组别存活时间/d生命延长率/%时珍国医国药, 2009, 20(9):2174-2175.荷瘤对照组13.0+6.8[3] 杨刚,杜守颖,吴清,等. HPLC法测定忍冬藤中绿原酸22.0+9.0"46.3样品B18.8+10.024.8及咖啡酸含量[J].中国药品标准, 2004, 5(4):47-50.样品C20.4+7.1'35.7[4] 蒋晔.郝晓花,冯玉梅，等. RP-HPLC非水相测定牛黄解样品D24.6211.3*毒软胶囊中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量[J].中CTX组.23.0+8.2”52.8 .成药, 2005, 27 (9): 1036-1038.注:与荷瘤对照组比较，"P<0.05, “P<0.01[s李海燕，宋汉敏，李振国.培元通脑胶囊质量标准研究[D].3讨论中国实验方剂学, 2013, 19(2): 129-132.由于中药成分较为复杂，单一的化学成分难以[6] 秦建平,陆艳芹,罗雪磊,等. HPLC同时测定火麻仁中a-亚麻酸、亚油酸和油酸含量[J]. 中国实验方剂学杂志,代表整个处方的功效。故在蒲薏颗粒的工艺研究中，2012, 18(7): 71-74.根据本方的临床用途，选择药材中的主要有效成分[7] 罗云，朱梦良，赵海平，等.不同厂家六味地黄浓缩丸多作为化学指标，选用EAC小鼠生命延长率作为药糖含量比较[J].时珍国医国药, 2013, 24(2): 289 290.效学评价指标，以水提、水提醇沉、乙醇提取、醇[8]瞿叶清,陈军,林爱华，等.马钱子总生物碱复合磷脂脂水双提4种方法提取，优选出醇水双提的提取方法,质体的抗肿瘤作用研究[J].中国实验方剂学杂志, 2012,使其生产工艺更趋科学、合理。18(3): 143-145.S45-48 DMSO 提供甲巯基通过S、Ar反应得芳基甲硫醚Jones-氟(或氯)离去,得相应芳基甲硫醚,氟苯7例收率60%~ 81%，Mensah E等[Tetrahedron Lett, 2014, 55: 5323]氯苯3例收率21%~ 52%。对二硝基苯得4-甲硫基硝基苯收带吸电子基(硝基、氰基、甲酰基)的氟(或氯)苯在率80%。这是中国煤化I基的SsAr反应。N,N-二异丙基乙胺(1.0 eq)和水(1.0 eq)中,与DMSO加热反应，[张清泉摘]MHCNM HG