RNA干扰与技术

第20卷第6期生物学杂志Vol.20 No.62003年12月.JOURNAL OF BIOLOCYDe,2003文章编号:1008 - 9632(2003)06 - 0005 - 03RNA干扰与技术孙剑,2(1. 天津大学药物科学与技术学院,天津 300072;2. 军事医学科学院基础所,北京 100850)摘要:RNA 干扰(RNA iterference, RNAi)是由双链RNA诱导的、序列特异的基因沉默机制。它是自然存在于植物、线虫和.果蝇中抵抗外来基固(包括病毒、转座子)入侵的方式。在哺乳动物细胞中,能够人工诱导RNA干扰,沉黩有同源序列基因表达。这一新技术具有特异性、高效性。因此,正被用来研究人类基固组的功能肿瘤和抗病毒感染等。关键词;RNA干扰;小干扰RNA;基因沉默中图分类号:Q52,Q75文默标识码:ARNA干扰( RNA interference, RNAi)是由双链RNAdependent RNA Polymerase , RdRP)的作用下,合成新的双诱导的能在细胞内有效地抑制有互补序列内源性基链RNA。再由Dicer 作用,产生新的小干扰RNA,完成因的现象。它是1998年Fire 等在研究反义核苷酸时发小干扰RNA的放大过程[3]。现,在线虫体内，双链RNA ( double stranded RNA,2小干扰RNA诱导哺乳动物细胞内RNA干扰技术dsRNA)能有效地抻制有互补序列内源性基因,而且抑2.1 化学合成的小干扰RNA制效果优于单链反义RNA。因此提出了双链RNA诱尽管双链RNA在植物和果蝇细胞中诱导RNA干导的RNA干扰(。随后的研究证实,RNA干扰是自然扰将双链RNA转入常用的哺乳动物细胞内(如人胚肾存在于植物、真菌、果蝇等生物中,序列特异的基因沉293细胞、小鼠成纤维细胞NH3T3等)未引起特异、有默( gene-silencing)机制。效的RNA干扰现象[4]。这可能与大于30个碱基的双鉴于RNA干扰的特异性和高效率,目前,国外正研链RNA在哺乳动物细胞内引起非特异的蛋白合成抑制究如何在哺乳动物细胞中诱导RNA干扰的技术,来研等细胞毒效应有关[5]。在改用化学合成的21个碱基究基因的功能。并希望RNA干扰技术应用于临床,治小干扰RNA后,可以在哺乳动物细胞内引起特异的疗肿瘤、病毒感染等疾病。已经取得了良好的实验结RNA干扰现象06。这使RNA干扰技术应用于哺乳动果。本文着重介绍RNA千扰的原理和哺乳动物细胞内物成为可能。诱导RNA干扰的技术。化学合成法人工制备小干扰RNA,一般是分别合RNA干扰的原理成21个碱基的意义链和反意链。在细胞外,将意义链RNA干扰是由双链RNA诱导的。在细胞内,双链和反意链混合。适当的温度下,互补碱基配对形成小RNA前体由核酸酶II(RNase II) - Dicer处理为21 ~23干扰RNA。然后,采用传统转染的方法,如lipfectarnin个碱基的小RNA,才能诱发RNA干扰。因此,称这类转染、电打孔等将小干扰RNA导入细胞、诱导RNA干小RNA为小干扰RNA( smalll interfering RNA, siRNA)。扰。此法操作简单、快速。只是引起的RNA干扰效应小干扰RNA是由19~ 21个碱基配对形成的双链,并在往往是暂时的,难以持久。因此,目前正探讨哺乳动物其3'末端有两个游离末配对的核苷酸。它在与解螺旋细胞内表达小干扰RNA,能维持长久的.可诱导的RNA酶、核酸酶等结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-干扰效应。inducing silencing complex, RISC)后,能引导RISC与互补2.2 细胞内表达的小干扰RNAmRNA结合将mRNA降解[2]。在转录后水平,抑制基这种方法是将表达小干扰RNA的载体转染细胞,因的表达，因而,又称为基因转录后沉默(pot-在细胞内表达小干扰RNA,诱导RNA干扰。根据产transcriptional gene silecing, PTGC)。生小干扰RNA的方法不同，可大概分为两种类型:第在小干扰RNA诱导的RNA干扰过程中,可能还存-种类型是将意义链和反义链表达在同一条RNA链在小千扰RNA的放大过程,以维持它的RNA干扰诱导上，中间隔有3~9个碱基。因而，可以折叠、碱基.功能。此过程推测是以小于扰RNA为引物，互补配对，形成柄=环(stem-loop) 样结构的RNA[7]。 在构mRNA为模板,在RNA依赖性RNA合成酶(RNA-建表达质粒时，将小干扰RNA序列按5'→3'和3'→5'收稿日期:2003-06-11作者筒介:孙鍘(1963- ),男,山东诸城人,军事医学科学院博士生、副教授中国煤化工TYHCNMHG5第20卷第6期生物学杂志Vol.20 No.62003年12月JOURNAL OF BIOLOGYDec ,2003的方向插入质粒。因此，转录的RNA产物是意义链-.过碱基互补形成双链的小干扰RNA{8]。在构建表达质隔-反义链。第二种类型是将意义链和反义链表达在粒时，意义链和反义链序列分别插人同一质粒上的两不同的RNA链。然后，在细胞内，意义链和反义链通个表达盒(图1)。promoter_Antisense] C Sensc_C AmtisenseJ-5'一+ 3'3'←5']转录转录转录后碱基配对SenseAntisense碱基配对柄环样RNA小千扰RNA图1两种在细胞内表达小干扰 RNA的方法示意圄Figue 1 Scbematics of two ways producing aiRNA in mmalin cells两种类型表达小干扰RNA的启动子一般都选用快人类基因组的功能分析。此外, RNA干扰也被用来RNA聚合酶川(polymerase II, Pol II)的启动子,如人核研究调节体内代谢的相关基因。对线虫基因组的RNA酸酶P RNA H1 (human RNase P RNA H1)和小核RNA干扰分析发现,305种基因功能的缺失导致线虫体内储(small nuclear RNA, snRNA) - U6的启动子。这类启动存脂肪下降,而另外112种基因的失活引起体内脂肪增子有两个特点。转录产物是没有聚腺背酸尾的小加。其中许多基因是新证实参与脂肪储存,并在人类RNA。并且,转录的起点和终止点明确。这些特性有利有同源。因此,这些基因在人体内的表达失调可能与于合成短链的小干扰RNA。因此,优于其它启动子。肥胖以及相关疾病有关,有望成为治疗肥胖的新靶第一类的柄-环小RNA在细胞内表达后,可以特点[10]。相信使用RNA干扰研究基因组,将发现参与其异的抑制同源序列基因的表达。抑制效应与细胞外合它生理、病理过程的相关基因。成的小干扰RNA相似,环的大小明显影响抑制效果,9RNA千扰技术正显示出在临床应用的巨大潜力。个碱基环的柄-环RNA作用最强,5个碱基环的柄-在抗病毒感染的实验研究中发现,小干扰RNA在哺乳环RNA没有作用,原因还不清楚。PAGE 电泳证实,柄动物细胞中诱导的RNA干扰能显著的阻止HV11]、流-环RNA在细胞内可成熟为小干扰RNA(图1),并且，.感病毒[12]、丙型肝炎病毒[13]感染细跑。在肿瘤的研究稳定转染后2个月,小干扰RNA仍在细胞内表达,未发方面,RNA干扰降低癌基因- BRC/ABL的表达,引起癌现明显的细胞毒效应。提示,这种RNA干扰技术稳定、细胞生长的抑制,并诱导细胞凋亡[14)。随着对RNA千可靠1。扰机制的进一-步认识和小干扰RNA技术的改进,RNA第二类细胞内表达的双链小干扰RNA,在人Hela干扰技术将会有广 阔的应用前景。细胞系中可特异的抑制同源基因的表达。PAGE电泳参考文献:证实,小干扰RNA在细胞内,要比对照的单链的意义链RNA或反义链RNA稳定。可能是由于形成双链，能抵[1]Fre A, Xu S, Montgonery MK, et al. Potent and speic geneicinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis egans[J].抗细胞内核酸酶的作用。小千扰RNA的抑制作用可以Nature , 199186696 :806- 811.根据其所针对基因位置的不同而不同。最强的可以抑[2]Bemstein E, Candy AA, Hanmond sM, a al. Role for a bidentale制86%的基因表达,最弱的没有抑制作用。因而,小干riborueclease in the initation step of RNA interference[J]. Narure,扰RNA的效应是靶点依赖性的。此外,在同一个质粒2001 ,409(6818):363 ~ 366.上表达的两种小干扰RNA,可以分别抑制对应靶基因[3]Sijan T,leenoe J,Sinmner F,e adl.On the mole d RNA mplifcation in的表达。这些研究结果为以后设计小干扰RNA提供了daRNA- tiggered gene eilencing[J]. Call ,2001 107(4):465 ~ 476.良好的参考[8]。[4]Caplen NJFloenor J, Fire A, et al. deRNAndliated gene silencingin culnured Droeophila ell; a tsue culure mdel for the analysis3展望of RNA iterfence[]]. Cene ,000,2521 ~2):95 ~ 105.小干扰RNA诱导的RNA干扰自发现以来,发展迅[5]Minks MA, West DK, Benvin s, et al. Stuctural requremente o速,利用RNA干扰已成功的分析了线虫86%基因组的oul |中国煤化工-' - oligo(A) palyoene功能[9] ,相信使用这种简捷、方便的技术,将有助于加Clela Clls[J]. J BiolMHCNMHG第20卷第6期生物学杂志Vol.20 No.62003年12月JOURNAL OF BIOLOGYDec,2003Chem , 1979 254(20): 10180~ 10183.2003 ,421(6920):268 ~ 270. .[6] Elbesir SM, Harborth J, Lendckdl w,et al. Duplescs of 21-[11] Jaxque J, Tiques K, Sevenon M. Molulation of HV - 1nucleotide RNAs nodiate RNA inteference in culured mamalianreplication by RNA itererence[J]. Natue , 2002 ,418(6896):ells[J]. Nature ,2001 ,411(6836):494 ~ 498.435 -438.[7 ] Brumelkamp TR, Bemarls R, Agami R. A System for Stuable[12]Ge Q, McManus MT,Nguyen M T, Shen C, et al. RNA interferenceExpesion aof Short Inerering RNAs in Manalian Cells [J].of influenra vinus prduction by direaly trgeting mRNA forSiene ,002,2965567)550~ 553.degnadation and indirecly inhibiting all viral RNA trenseription[J].[8]Miyngishi M,Tairn K. U6 prumoler-driven siRNAs with four uridineProc Nar1 Aoad 8xi USA ,2003, 100(5):2718 ~ 2723.3’ overhangs eficienty suppress targeted gene expression in[13]Wilon JA,Jnyasena s, Khvorova A, ex al. RNA iterference blocksmarunalin ells[J]. Nat Biotech, 2002 ,20(5):497 - 500.gene exrossion and RNA synthesis from bepettis C[9]Kanath RS, Fraser AG,Dong y,et al. Syetemic funcinal analysis ofrepliconspropagated in bunen liver cll[J]. Proc Natl Acad Saithe Caenothabdis elegans genome using RNAi[J]. Nature ,2003,USA ,2003, 100(5):2783 ~ 2788.421(6920):231 ~ 237.[14]Wilda M, Fuche U, Wosman w, et al. Klling of Ieukenic cells[10]Ashra6i K,Chang FY,Wats JL,et al. Gemome wide RNAi analysiswith a BCR/ABL fusion gene by RNA iterference (RNAi)[J].of the Caenochabditis elegans fat regulatory genes[J]. Nature,Oncogene ,2002,21(37) :5716~ 5724.RNA interference techniqueSUN Jian(ollege of Phammaceuticals and technology , Tianjin University ,Tianjn,300072, China)Abstact: RNA interference(RNAi) was dsRNAs (double-stranded)-induced sequence-secific gene-silencing mechanisn. Itwas a natural resistent way against invasion of foreign genes ( like virus, transposon) in plants, C. elegans and Drosophila.RNAi can be induced by small interfering RNA ( siRNA) to silence expression of homologous gene in maenmalian cells. RNAiwas used in functional analysis of human genome , and would be potential therapeutie approach to treat cancer and prevent virusinfection due to its highly speificity and eficiency.Key words: RNA interfering; siRNA; gene silencing(上接第10页)[7]Slter D, Gearhatr J. Puting stem cells to work[]. Science , 1999分化[J].生物学通报,2002,37(1);1-3.283:1468 ~ 1470.[3]丛笑倩,夏汉顺,徐露露,等.外源TCF-B1基因在小鼠ES细[8]Evans MJ, Kaufman MH. Esabishment in culure of pluriptent cells胞中的表达及其对细胞分化的影响[J].实验生物学报, 195,5from mouse embryos[J]. Nature , 1998,292:154- 156.28:173- 189.[9]honson JA, Itkoviz Eldor J, Shapjiro ss, et al. Embryaric stem cell[4]许汉鹏,等.人神经干细胞体外培养体系的建立[J].第四军lines derived from human blastocysts[J]. Srience ，1998.282: 1145医大学学报,2001 ,22(2): 185 ~ 186.~ 1147.[5]杨波,等 .人胚神经干细胞的分离与培养[].河南医科大[10]Kchat I, et al. Human embyonic stem cells can dfereniale into学学报,000,35(6):504 ~ s05.myocytes with structural and functional properties of cardionyoeytes[6]刘仁勇,等.成年大鼠纹状体区神经干细胞的分离培养[J].[j].J Cin Inwest ,001.108(3):407 ~ 414.解剖学报, 2000,31<(1);17-21.[11] Kesler PD, Bymne BJ. Myoblast cell galting into heart muecle:Cllular Biology and Potenial Apcacins.Theory and research advances on stem cellsQIAN Fang(Gaoyou camp, Yangzhou Educational College, Gaoyou, 2256000 China)Abstract: The stem cells research was the most active area in curment cell engineering. The stem cells were lassified anddefined . The comparative study between embryonic and the adult stem cell was taken, and the applications of stem cells techniquewere introduced . The great potentiality of the stem cells particularly the embryonid stem cells in medical science and the wholelife science were revealed, and the great reforns were made in the medica中国煤化工Key words: stem cll; embryonic stem cll; adult sten cellTYHCNMHG7