AmpliDet RNA技术

中国生物工程杂志第23卷第12期CHINA BIOTECHNOLOGY2003年12月AmpliDet RNA技术刘春燕*陈庆山梁秀瑞张立军李文滨(东北农业大学大豆研究所150030)Q7 A摘要随着分子生物学发展,核酸实时定量检测已成为人们研究的 热点问题。分子标灯与NASBA结合实时检测ssRNA发展成为一种新技术，称为AmpliDet RNA。就NASBA扩增原理、分子标灯的结构和AmpliDet RNA的特点及应用作一简单介绍。关键词分子标灯 NASBA AmpliDet RNA sRNA随着分子生物学技术的迅猛发展,核酸体外扩体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。反应在.增巳在各实验室得到普及应用,进而在扩增过程中42C进行,扩增速度与PCR -样快,在3h内可扩增做到实时定量检测已成为人们研究的热点问题。1000万倍(1。NASBA技术均-.地等温扩增特性扩目前核酸检测常用的方法有DNA印迹、RNA印迹、大了它的应用范围,并且用NASBA扩增双链DNA酶联免疫法(ELISA)等,这些技术操作繁琐复杂,费也已有报道。时,技术难度大,而且难以对核酸进行准确定量检NASBA反应依赖于AMV反转录酶.RNA酶H、测"。而分子标灯是与PCR、 RT-PCR、NASBAT,RNA聚合酶共同协作完成,标准的NASBA反应( nucleic acid sequence- based amplification) 相结合进体系除以上3种酶外,还应有脱氧核糖核苷三磷酸行核酸定量检测的一种新技术。其中分子标灯与(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)、两个特殊的引物NASBA结合是一种实时检测特异单链RNA和适宜的缓冲液。其中引物I 3’端与靶序列互补，(ssRNA)的有效方法，这种新技术称为AmpliDet5'端具有被T,RNA聚合酶识别的启动子序列,引物RNA,现已在许多诊断研究方面得以应用”。II的5'端序列与靶RNA序列相同5.6]。NASBA技术是体外等温扩增ssRNA 的酶促过程。NASBA整个反应分为两相:非循环相和循环.该反应依赖于AMV反转录酶(AMV-RT)、RNA酶H相。如开始用RNA靶序列,反应将如此进行:首(RNaseH)、T,RNA聚合酶(T, RNA polymerase)共 同先,5'端含有RNA聚合酶启动子序列的引物I与协作扩增反义原靶序列RNA。分子标灯是一种与靶序列复性,并由反转录酶催化产生一cDNA链,核酸杂交能产生荧光的一种新 型探针'”。分子标以RNaseH降解新生成的双链螺旋中的RNA,这样灯与NASBA结合能高通量检测核酸,同时,扩增与生成了带有启动子序列的eDNA,称为非循环相。检测在同- - 封闭管内进行,臧少了核酸交叉污染的然后,引物I与裸露的cDNA复性,进行第二链的危险,减少中间操作步骤,省时省力。现将分子标合成,启动子序列变为双链。这时, RNA聚合酶可灯技术与NASBA反应原理及AmpliDetRNA定量检以合成一反义原靶序列的多个拷贝启动子序列。.测核酸的应用作一简述。反过来,它们又可作为反应循环相中cDNA合成模板,继续合成反义原靶序列RNA。过程见图1。1 NASBA扩增反应原理NASBA的特点是操作简便,不需特殊仪器,不NASBA(依赖核酸序列的扩增)是AmpliDet需温度循环，整个反应过程由三种酶控制,循环次RNA技术中扩增目的RNA片段的步骤。1990 年由数少,忠实性高。由于反应不需高温变性步骤,所.Guatelli首次提出的由一对引物指导的连续均一的以NASBA不会受到双链DNA的污染。同时由于外来双链DNA无T,启动子序列,不可能被扩增，这就大大提高了NASBA反应的特异性,适于检测收稿日期:2003-08-04修回 日期2003-09-24*电子信箱:eyliucn@ botmail. com中国煤化工TYHCNMHG第12期刘春燕等:AmpliDet RNA技术79RNA引物I.↓rT 5'非循环相RNA:DNA↓RNase HDNA(-)|3'- 5引物,Ty RNA polymerase循环相T, RNA polymerase/3'"一5' 引物1IRNA()3'-RTxTDNA(+)引物1RNase H圈1 NASBA 反应过程{圈中引物I倾斜部分为T7启动子序列)核酸存在时,分子标灯保持茎环结构,荧光基团与2分子 标灯的结构及作用原理淬灭基团距离较近,产生的荧光能量根据荧光共振分子标灯(molecular beacon)自1996 年问世以能量转移原理转移到淬灭基团,并且以热能的形式后,已广泛应用于PCR反应的实时检测、活体细胞散发出去,从而检测不到或仅有微弱荧光本底。当中DNA-RNA杂交的实时检测、DNA突变分析等[']。靶核酸存在时,茎部结构由于环状部分结合靶序列分子标灯在AmpliDetRNA技术体系中与NASBA扩而被打开，荧光基团与淬灭基团分开,荧光产生。增子杂交产生荧光,从而对NASBA扩增反应产物分子标灯检测核酸的三大特点是特异性、信号进行实时检测。放大和产生荧光[回。荧光产生依赖于分子标灯茎分子标灯是根据核酸碱基配对原则和荧光共环结构的稳定性,而前两者则依赖于探针与目标分振能量转移( fluorescence resonance energy transfer,子杂交的长度及茎部的稳定性。FRET)现象设计的17.8。分子标灯为一茎环结构的3 AmpliDet RNA特点及应用寡核甘酸探针,其环状区核甘酸序列与靶序列互补,靠近两端的部分序列构成分子标灯的茎部,大3.1 AmpliDet RNA特点约有5-7个碱基对,两端分别标记荧光基团分子标灯与NASBA结合应用技术被称为(fluorophore)和淬灭基团(quencher)(图2)。没有靶AmpliDet RNA技术。该技术与RNA印迹等方法比.扩增子RNA8°分子标灯圈2分子标灯的作用模型F(furophore)荧光基团;Q( quenche)誶灭基团中国煤化工TYHCNMHG80中国生物工程杂志第23卷较, AmpliDet RNA具有相同的特异性与灵敏度,并通过凝胶电泳后经Northem杂交进行检测。而另便易于操作。由于整个过程在微量封闭的离心一份通过分子标灯进行检测,证明AmpliDetRNA管内进行,消除了核酸交叉污染的可能。AmpliDet检测准确可靠,灵敏度更高,并且易于操作。由于RNA除了能实时检测sRNA外，还可应用到其他分子标灯在反应开始就需加入到反应管内,这就有许多方面,如:生物活性的预测、基因表达、细胞生可能由于分子标灯与扩增子的杂交而阻滞了存力的检测等。根据AmpliDet RNA的原理和目前NASBA反应体系继续进行,因此应对实时检测的实验结果，与常规核酸检测方法相比,AmpliDetNASBA反应进行优化。Cionate Leone 通过设计具RNA具有以下特点。(1)液相杂交检测:常规检测有不同结合位点的分子标灯和引物来克服这一现方法主要为固相杂交,通常把核酸片段变性后转移象,并检测了从100pg 到10fg-系列稀释10倍的.并固定于支持膜上,用标记探针进行杂交[10]。因PLRV病毒RNA。此要把未结合的探针和引物分离后才能利用其他3.2.2多 重AmpliDet RNA实时检测多个目的基因信号对靶核酸进行检测。而AmpliDet RNA可以直或核酸的不同位点同时检测在植物疾病 诊断过接在紫外灯下或借助荧光光谱仪进行定量检测。程中,分子标灯的应用已较为普遍。该技术能灵敏(2)准确性高:分子标灯与NASBA结合实时检测核的检测到微量的植物病原体。在植物发病过程中，酸要优于分子标灯与PCR或RT-PCR结合检测核不单是由一种病原体致病,有可能是几种病原菌共酸。这是因为NASBA是连续均一的等温扩增过同作用导致植物发病的。因此利用多重检测技术程,反应在42C进行,这就省去了在PCR和RT-同时检测几种病原菌显得尤为重要。在利用PCR反应中高温变性的步骤,排除了分子标灯因高AmpliDet RNA实时检测单-目的基因的基础上,发温变性而使杂交茎部打开产生荧光的可能。也就展了多重AmpliDet RNA技术。在具有不同目的基是说只有分子标灯的环状序列不断与扩增子杂交因的反应管中加人带有不同颜色荧光基团的分子才能产生荧光信号,提高了实时检测RNA的准确标灯进行检测。常用的荧光-淬灭分子对有:香豆性。(3)特异性强:在对分子标灯与靶序列杂交特素(蓝色)-DABCYL; EADNS(蓝绿)- DABCYL;荧光异性研究中发现,与线性寡核苷酸探针相比，茎环素(绿色)-DABCYL;荧光黄-DABCYL;四甲基罗丹状结构的分子标灯检测特异性高，对靶序列中单个明(橙色)_DABCYL;得克萨斯红- DABCYL等。经实碱基的错配、缺失或插人突变均能检测出来。(4)验证实,这个技术体系的可靠性和灵敏性要高于酶灵敏度高: AmpliDet RNA能检测到低至1拷贝的核联免疫( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)酸,敏感性很高。(5)对 靶核酸实时检测:在NASBA检测和Northerm杂交等技术。由于NASBA扩增技体系中加入分子标灯,并把扩增仪与荧光光谱仪相术比RT-PCR灵敏,同时AmpliDet RNA不使用凝胶连,可以对NASBA反应过程随时进行检测。(6)有检测，使得该技术优于多重RT-PCR检测技术"。效消除核酸交叉污染:利用分子标灯可以直接对封Klerks等8已利用该技术成功地同时检测了马铃闭微量离心管进行检测,完全避免核酸中间操作环薯卷叶病毒(PLRV)和马铃薯病毒Y(PVY)两种病节,彻底消除核酸交叉污染。(7)可大通量的检测毒的核酸含量。在同时检测马铃薯两种病毒时，核酸:NASBA与分子标灯结合可实现核酸的大规Klerks等通过在反应管内加入低浓度内参照物IPC .模自动化检测。来消除假阳性。IPC序列与目标RNA几乎相同,但3.2 AmpliDet RNA检测核酸的应用有3~20个核苷酸的差异,用具有不同荧光基团的3.2.1 AmpliDet RNA能均一的实时检测单一目的分子标灯来检测IPC扩增子。所以在扩增检测中RNA在NASBA扩增体系中应用分子标灯可随着应始终有IPC的荧光信号产生,这样进一步提高了扩增的进行均一的产生荧光信号。这是因为.AmpliDet RNA技术的准确性。Eun AJC等[12}设计NASBA是连续均一的等温扩增过程,使分子标灯了4种分子标灯同时检测了兰花花叶病毒的环状序列不断与扩增子杂交产生荧光信号进行(CymMV)和兰花环斑病毒( ORSV)两种病毒中RNA实时检测。Gionate Leone 等[2}已把AmpliDet RNA依赖的RNA聚合酶基因和病毒外壳蛋白基因。该成功应用于马铃薯卷叶病毒(PLRV)的核酸定量检技术在两病毒共侵染的100mg兰花叶片中同时检测。在实验中NASBA扩增子被均分为两份,一份中国煤化工毒。多重AmpliDtfYHCNMHG第12期刘春燕等:AmpliDet RNA技术81RNA技术成功地应用到了兰花产业,为兰花的抗. [ 2 ]Gionate Leone, Harm van Schjnde, Bob van Gemen .e1 al .病育种提供了先进的手段。由此可见，多重Molecular beacon probee combined with amplification by NASBAenable homogeneous, ral-time delectio of RNA. Nucleic AeidaAmpliDet RNA技术可应用到不同作物的多个病毒Reearch, 1998 ,26 (9):2150- 2155.检测。多重AmpliDetRNA不仅可以对多个病毒同[ 3 ]Tyagj S,Kramer F R. Molecular beaconsprobes ihat fuoresce upon时检测,还可以检测同一病毒的不同株系。Szemeshybridizaion. Nat Biolechnol, 196,14(3):303 - 308等川采用NASBA扩增马铃薯病毒Y(PVY)中编码[ 4 ]Compton J. Nucleic acid Bequence based aplifcation.n Noture,外壳蛋白基因并用分子标灯检测成功地分离了1991.350:91 -92PVY~、PVYorC.、PVYT三种株系。同时利用该技术[5]颜进.NASBA及其在医学上的应用.国外医学.临床生物化成功地分离了来自6个国家的47个PVY株系,经学与检验学分册1997.18 (2)6-6-6验证,分离结果与这些株系的生物性状一致,准确[ 6]Kierils T, van Gemen B, van Strjp D.et al. NASBA isothermal可靠。enzymatic in vitronucleie acid amplfcation opimized for HIV-I3.2.3利 用AmpliDet RNA检测单核苷酸多态性dingnois . Jourmal of Virological Methods, 1991 ,35(3) :273 ~ 286[ 7 ]Tan W.Fang X,Li J, et al. Molecular beacons:a novel DNA probe(SNP)14.51随着人类基因组计划研究进展,已经for nucleic acid and prolein studies. Chemistry 2000.6(7);1107 -在人类基因组中鉴定出200多万个SNP。由此可1111以推知,在植物、动物的基因组中也存在一定量的[8]Klerks MM，Leone GO, Verbek M,er al. Derelopment of aSNP。而且这些SNP在植物进化、生长发育、抗病muliplex AmpliDet RNA for the sinultaneous decction of potato性等方面起着重要作用。这使SNP成为基因研究leafroul vinus and potato vinus Y in potato tubers. Journal of的有利工具。对这些SNP近一步的研究具有深远Virologcal Methods ,2001 ,93(1-2):115- 125意义。利用分子标灯与NASBA结合检测的优点是[ 9 JSsemes M, Schoen CD. Design of molecular beacons for AmpliDet可以把多个样品集合同时检测，对微量样品的检测RNA asay Charceriration of binding sability and probespeificity. . Analyical Biochemistry , 2003 ,315(1~ 2):189 ~ 201具有很高的灵敏度。[10]刘明军,王立荣,王兆五.核酸定量检测技术的进展及应用.3.2.4利用 AmpliDet RNA实时检测目的DNA分医学信息200.10 (6) :340-342子NASBA技术传统上是扩增ssRNA行之有效的[11]Burchill SA,erebolte L,Jobnston C. et al Comparison of the RNA-方法。但现在有一些实验室也采用NASBA技术扩amplifcation based methods RT-PCR and NASBA for the dection增双链DNA。只要反应中加人变性步骤,即在等温of cireulaing tumor cll. British Journal of Cancer,2002, 86 (1):反应进行前使双链DNA分子变性成为单链,同时102- 109在引物设计、样品的提取方法和模板变性等方面做[12] Alrin Jin Cheng Eun, Sek-Man Wang. Moleular beacons: A new一些修改,就可以利用NASBA有效扩增双链DNAepproech to plat virus dection. Pyopahlgyy .20090(3) :269- 275分子。用AmpliDet RNA检测DNA分子优点为反应[13]Szenes M,M klerkes M, van den Heuvel J F] M,et al. Development在一等温封闭管内进行,减少中间操作环节,免除of a multiplxs AmpliDet RNA 8y for simulaneous deletion and核酸交叉污染的可能,同时允许高通量检测目的typing of potato virns Y inlates. Journal of Virological Methods,DNA分子。Yales 等[16]采用AmpliDet RNA技术实2002,100 (1-2):83 -96.时检测定量了乙型肝炎病毒(HBV),并检测到了人[14]aras SAE, Kramer FR, Tyaji s . Muliplex deteticon of single-类血浆每毫升中HBV DNA 10'~ 10°拷贝不等。该nucleoide varaions using moleular beacons . Cenetic Analysis:方法具有很好的重复性和精确度。与其他DNA检Bionoleculer Engineing, 199,14(5- 6):l51- 156测技术相比,AmpliDet RNA具有更好的灵敏性和较[15] Mhlanga MM , Malmberg L. Using mlecular beacons l0 detct大的动力学范围,并且可以高通量检测。这使eingle nuclotide polymorphismns with real time PCR. Methods,2001 ,25(4):463 -471AmpliDet RNA技术在检测目的DNA分子的应用上[16]Yates s. Penning M, Goudenit J,et al. Quantiative detection of也有广阔的前景。hepeitis B vins DNA by rel-lime mucleic acid sequence-based参考文献amplification with molecular beacon delection. Jourmal of ClinicalMicrobiology ,2001 ,39( 10) :3656 - 3665[1]陈忠斌,王升启,孙志贤.分子信标核酸检测技术研究进展.(下转第94页)生物化学与生物物理进展,1998,25(6):488~492中国煤化工MYHCNMHG94中国生物工程杂志第23卷的克隆及结构分析.生命科学研究,003, 16(3);188 ~ 191[4]F.奥斯伯，R.布伦特,等.精编分子生物学实验指南.北京:[2]朱平,冯书章.抗体实验技术.长春:长春出版杜,94,415-科学出版社.1998. 200.565 - 581[s]许崇波.朱平.产气荚膜梭菌a毒素保护性抗原基因在大肠(3}张智清,姚立红,侯云德含PRPL启动子的原核高效表达载杆菌中的高效表达.中国普医学报, 19919(1):29 -32体的组建及应用.病毒学报，190612)11116High Expression of Recombinant Alpha-toxin's C-Terminal Gene ofClostridium perfringens Type A in E. coliLin Minghui' Yin Jun2 Xing Hongguang' Hou Xiaojun2 Wang Hui' Song Wei2(1 Laboratory Department of Genernl Hospital of Kunning Kunming 6500322 Institute of Microbiology and Epidemiology Academy of Miliary Medical Sciences Beijing 100071)Abstract After having been cloned and digested by the restriction endoenzyme EcoR I and Pst I , the modifiedalphatoxin' s C-terminal gene was connected with the expression vector pBV220 and then transferred into the host cellE. coli DH5a . Induced by 42 C , the cpa408 gene was highly expressed , which expression amount was to the 43.75percent of the totall bacterial protein. By analysis of SDS-PAGE , the molecular weight of the expression protein is about15.5x 10'Da. Analysised by Westem-blot , the protein could secificly react with the standard anti alpha-toxin.Key words Clostridium perfringens type A Alpha- toxin C- terminal gene High expression(上接第77页)包涵体复性研究进展龚平生罗贵民(吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春 130023)摘要用基因工程技术在大肠杆菌 高水平表达重组蛋白时,通常形成无生物活性的包涵体。包涵体在体外经分离、溶解与重折叠后可实现复性,表现为具有生物活性的蛋白。总结了包涵体的相关复性技术,重点介绍重折叠的最新进展情况。关键词包涵体 复性重折叠重组蛋白(上接第81页)The Principle and Application of AmpliDet RNALiu Chunyan Chen Qingshan Liang Xiurui Zhang Lijun li Wenbin(Instiute of Soybean Research Northeast Agriculural Univenity Harbin 150030)Abstract With the development of molecular biology, real-time detection of nucleic acid has become a hotproblem. AmpliDet RNA is a new technology for detecting nucleic acid combined nucleic acid sequence-basedamplification( NASBA) and molecular beacon. The principle of NASBA, the structure of molecular beacon, and thecharacteristics of AmpliDet RNA have been summarized.Key words Molcular beacon NASBA AmpliDet RNA ssRNA中国煤化工MYHCNMHG