棕榈壳发酵制取燃料乙醇的研究

棕榈壳发酵制取燃料乙醇的研究王琼1,2,庄新姝1,张字12,徐明忠12,许敬亮,李东2,袁振宏1(中国科学院广州能源研究所,中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室广东省新能源和可再生能源研究开发与应用重点实验室广东广州,510640)2(中国科学院研究生院,北京,100039)摘要尝试利用 Cadida shehatae ATcc34887、 Saccharomyces cerevisiae2.20251和 Saccharomyces cereus3株酵母功菌发酵棕榈壳的高温液态水水解液和纤维素晦水解液。晦解液与高温液态水水解液相比,发酵较容易,乙醇产率最高达到理论产率的70%面水解液发酵仍有许多工艺问题值得研究探讨关键词棕榈壳,发酵,燃料乙醇使用燃料乙醇作为车用化石燃料替代品已经很糖浓度为4.42g/L,大部分为木糖。第2步,将水解普遍。燃料乙醇是最直接、使用量最大的液体燃料,液中和脱毒然后取部分浓缩液用于种子液培养和发通过生物质原料,如玉米、木材来制备它是各国研究酵,其余部分同残渣一起进行酶解(纤维素酶购自的一大热点,而利用棕榈壳制备目前少有研究。棕榈 Sigma公司,加酶量为15FPU/g,温度50℃,水解12是一种重要的经济作物,在东南亚、南美洲、非洲的很h,糖浓度基本稳定)得到纤维素酶水解液(以下简多国家都有种植在我国广泛分布于长江以南大部分称酶解液),测得其还原糖浓度为28.06g/L,葡萄糖地区。由其果实制得的棕榈油是世界油脂市场的重约占80%。具体的原料处理流程见图1要组成部分121,而油脂生产过程中产生的大量棕榈粽榈壳原料壳尚未得到有效利用。本文初涉棕榈壳水解制乙醇高温高压液态水水解领域,选择使用休哈塔假丝酵母来发酵棕榈壳的水解中和脱毒后的水解液液,同时利用3个菌株来发酵其酶解液,对糖利用情部分液体残渣部分十剩余液体况、乙醇产率等进行了研究,为棕榈壳燃料乙醇的生浓酶水解液产打下基础液相部分残渣部分1原料及其处理方法木糖发酵己糖发酵图1棕榈壳原料的基本处理流程图通过范式分析的方法得出棕榈壳含有丰富的用扫描电镜观察棕榈壳原料和实验残渣的微观纤维素和半纤维素资源。几种常用的木质纤维素原结构变化,发现原料呈现沿径向条状纹路;水解渣显料,如小麦秆、稻秆、硬木、软木,其纤维素含量(质量示沿径向的纤维条有碎裂,质地开始疏松;酶解残渣分数)在30%~40%,半纤维素含量在25%显示良好的破裂情况,纤维条有序排列但是彼此连35%而棕榈壳的纤维素含量高达442%,半纤接松散。这表明高温液态水水解和纤维素酶水解都维素含量也较高(21.74%),有利于产糖发酵。在不同程度上改变了棕榈壳原料的结构,通过范式分棕榈壳原料的处理主要分2步。第1步,将粉碎析发现,半纤维素转化率(质量分数)达到90%,纤维后的棕榈壳过40目筛,105℃烘干至恒重,然后用高素转化率达到75%说明确实产生了大量的糖用于温高压液态水水解的方法(20℃,4.0MPa,液固比发酵。15:1,搅拌转速500r/min)得到水解液,测得其还原2实验方法第一作者:读硕士研究生(袁振宏为通讯作者)国家高技术研究发展计划(863计划)(2007AA0524062.12007AA100702);中国科学院知识创新工程重大项目(KSCX1-YW-11);中国科学院广州能源研究所所长创新基金中国煤化工酵木糖能力5~。,人才引进专项(06076510607681001)故本CNMHG Cadida shehatae收稿日期:2008-04-11,改回日期:2008-06-04(ATCC34887,以下简称1号酵母,购自中国工业微28年第斗4卷9顺(总需2期)65食品与发醉工 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES生菌种保藏中心)来发酵水解液,同时将其和酿酒酵条件下进行驯化培养,测OD值考察其是否到达对数母 Saccharomyces, cereuisiae2.20251(以下简称2号生长期酵母,由首都师范大学生命科学学院提供)、酿酒酵母2.3.3种子培养Saccharomyces, cerevisiae(以下简称3号酵母,由华驯化培养42h后,1号酵母进入对数生长期,将南农业大学食品学院生物工程系提供)一起发酵酶解5mL菌液接种到15mL水解液种子培养基中,于液30℃,130~135r/min培养60h2.2培养基活化培养的1、2、3号酵母各5mL接种到102.2.1活化培养基(g/L)mL酶解液种子培养基,于30℃静置培养60h。葡萄糖30,酵母粉10,蛋白胨5,麦芽浸膏10,2.3.4发酵pH5.0~5.5,115℃灭菌30min。水解液种子培养基按接种量10%接种到30mL2.2.2驯化培养基(g/L)水解发酵液中,发酵在50mL带透气塞的三角烧瓶木糖30,酵母粉10,蛋白胨5,麦芽浸膏10,pH中进行,条件是30℃,130~135r/min。此为1号发5.0~5.5,105℃灭菌20min酵液2.2.3种子培养基3份酶解液种子培养基同样按接种量10%分别2.2.3.1水解液种子培养基接种到30mL酶解发酵液中,发酵在50mL密闭的过中和脱毒处理:用Ca(OH)2调节pH为三角瓶中进行,条件是30℃,静置发酵。此为2、3、410.0,过滤去除沉淀;加热煮沸10min,补充水到原号发酵液。来刻度;活性炭吸附,1g/L,80min1以上发酵液均每隔一定时间取样,测定糖浓度和取部分水解液微沸浓缩,使得还原糖浓度为乙醇浓度,进而计算得到乙醇产率10.05g/L,向15mL培养基中加入2g/L酵母提取2.4分析方法物,3g/L蛋白胨,3g/LKH2PO4,0.3g/L尿素,2.4.1乙醇产率分析0.3g/LCaC1,0.3g/ L MgSO4作为营养物10用 agilent6820气相色谱仪分析发酵液中乙醇用稀HCl调节pH为酵母发酵pH,约5浓度。测定条件:初始温度40℃,最高温度250℃,升5.5。105℃灭菌20min,存储待用。温速率10℃/min,平衡时间1min,进样量1L。乙2.2.3.2酶解液种子培养基醇产率计算公式:将剩余的水解液和水解残渣进行酶解,获得还原X/%100糖浓度2806g/L的酶水解液。向3份各10mL酶解液培养基添加营养物(如上所述)。105℃灭菌20式中:X为乙醇产率%;C1为乙醇浓度,g/L;min,存储待用。C2为总还原糖浓度,g/L;N为计量系数,发酵己糖2.2.4发酵培养基N=0.51;发酵木糖,N=0.46。配制方法如种子培养基所示。水解发酵液302.4.2糖浓度分析mL,1份;酶解发酵液30mL,3份,存储待用。采用3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定水解液2.3培养方法酶解液和发酵液中的还原糖含量。2.3.1活化培养用高效液相色谱仪( Waters600HPLC)测定样品将冷冻保存的1、2、3号酵母用无菌水制成菌悬中葡萄糖和木糖的含量。测定条件:进样为 Waters液,于活化培养基中活化,条件为30~32℃,100r/717自动进样器,配有 Waters410示差折光仪和min。其中,2、3号酵母活化2d;1号酵母活化10h增 Waters Sugar Pak I柱;流动相:重蒸水流速:1.1殖后取部分转入驯化培养基(为发酵水解液做准备),mL/min;柱温:90℃;进样量:1oμL;0.22μm滤膜过其余继续活化(发酵酶解液)。滤后上高效液相色谱测定。2.3.2驯化培养9×10-6X休哈塔假丝酵母必须经过一定的驯化和种子液中国煤化面积培养才能提高其代谢木糖产乙醇的能力112,因此CNMHG10-6X取部分活化后的1号酵母于30~32℃,100r/min的Y为木糖浓度(g/L),X为峰面积。662008vo34No9( (Total249)生产与科研经验量死亡1,3结果和讨论3号发酵液的乙醇产率呈抛物线趋势,最大值约3.1水解液脱毒情况为57%,出现在24~36h。采用过中和脱毒的方法处理水解液。一些抑制4号发酵液的乙醇产率也呈抛物线趋势,最大值物在高pH值变得不稳定,过中和可以去除部分酮可达到70%,出现在12~24h。这说明3号酵母发类、糠醛;加热法可减少挥发性抑制剂的浓度,使水解酵酶解液产乙醇的能力优于2号酵母液的可发酵性增强;活性炭吸附可去除小分子化合物3.3可发酵糖分析的干扰,比如苯酚和乙酸)。但本实验中发现,该法如图3所示,除去6h时的不佳数据,1号发酵液使得水解液糖浓度有一定损失(减少约50%),并且中还原糖含量只是略有降低这和它较低的乙醇产率木糖损失多于葡萄糖,原因可能是活性炭吸附了较多是相当的,可见休哈塔假丝酵母利用木糖发酵仍然是的糖,所以活性炭是否需要添加以及其用量需要再探需要探索的步骤。索。通过HPLC发现,中和脱毒前后各产物峰的变化不大,说明中和脱毒并未起到应有的作用,这是棕榈壳水解液的独有现象还是其他原因,需在今后实验中进一步研究。3.2乙醇产率分析40各发酵液中乙醇产率随时间的变化情况如图2所示。发酵6h时,1号发酵液的乙醇产率达到最高122436值10.05%随后变化缓慢,略呈下降趋势。主要原因可能是该酵母种子液驯化程度不够,未完全开发其◇—1号发酵液;-△-2号发酵液利用木糖产乙醇的能力;另外可能因为水解发酵液脱-3号发酵液;-□—4号发酵液图3发酵液中还原糖剩余率随时间的变化毒不够、成分复杂,不利于1号酵母的生长,使其难以2号发酵液糖浓度始终变化不大,这和其他文献利用糖分。报道的休哈塔假丝酵母有较好的利用葡萄糖能力相悖,如前所述,有可能因为1号酵母不能耐受高浓度乙醇而死亡,值得进一步研究。3、4号发酵液均取得了良好的发酵效果,还原糖(主要成分是葡萄糖)浓度迅速减少。在24h后,2种发酵液残糖的百分率基本稳定,可能仅剩酿酒酵母不能利用的某些糖4结论◇1号发酵液;-△-2号发酵液-3号发酵液;-口4号发酵液(1)利用3种不同菌株来进行棕榈壳水解液和酶2发酵液中乙醇产率随时间的变解液的发酵研究。其中S. cerevisiae和S. cerevsiae2号发酵液的发酵效果同样不理想,乙醇产率2.20251发酵酶解液产乙醇的能力都较高(以还原糖基本为2.58%。2号发酵液的总还原糖浓度计,乙醇的最高产率分别达到了70%和57%),而(28.06g/L)远大于1号发酵液(10.05g/L),但其乙 Cadida shehatae发酵水解液和酶解液的效果均不理醇产率不及1号,说明休哈塔假丝酵母在水解发酵液想(乙醇的最高产率只有10.05%和2.58%)中确实利用了部分木糖。休哈塔假丝酵母通常先利(2)实验数据表明, Cadida shehatae经过一定的用葡萄糖然后再几乎同时利用半乳糖、甘露糖、木驯化后县有发酵水解液产乙醇的能力。但是仍然需糖11,然而2号发酵液中,该酵母在葡萄糖等己糖要进中国煤化工 dida shehatae代占绝对优势的环境中不能正常发酵极可能是在活化谢木棚CNMHG,最终使其能够适培养或者种子液培养时因不能耐受高乙醇浓度而大应水解液复杂的环境,产出更多的乙醇208年第34卷第9期(总第24)67食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUS(3)实验中,2种不同酵母发酵酶解液均取得良Pachysolen tannophilus, Candida shehatae and Pichia sti好效果,说明采取已有的发酵工艺来发酵棕榈壳酶解ri[J. Industrial Microbiology and Biotechnology,液,可行可靠1990,6:157~164(4)棕榈壳的纤维素含量和半纤维素含量都较7 du jC Preez, Prior B A, Aida M T Monteiro. The effectof aeration on xylose fermentation by Candida shehatae高,在乙醇生产领域具有广阔的应用前景。and Pachysolen tannophilus[J]. Applied Microbiology and参考文献Biotechnology, 1984, 19(4): 261-2668李素玉,陈新芳,田沈,等.木质纤维素酒精发酵菌种的1金青哲,郑耀坤.国际棕榈油产品的新进展[刀].粮油食品筛选[门.太阳能学报,2003,24(2):218~220科技,2007,15(2):599钱明宇,杨秀山燃料酒精生产中对木质纤维素稀酸水解2程黔后期棕榈油市场何去何从[].粮食与油脂,2007,液的脱毒处理[]太阳能,2005,(2):49(8):37~3910曹军卫,马辉文.微生物工程[M].北京:科学出版社,3薛惠琴,杭怡琼,陈谊,等.稻草秸杆中木质素、纤维素测定2006.82~84方法的研讨[].上海畜牧兽医通讯,2001,(2):1511余世良,罗廉,李杰,等.休哈塔假丝酵母对半纤维素4朱锡锋生物质热解原理与技术[M].合肥:中国科学技术戊糖和己糖的同步发酵[].林产化学与工业.1991,11大学出版社,2006.28(1):185 Delgenesa J P, Molettaa R, Navarro J M. Effects of12岳瑞雪,陈叶福,肖冬光等休哈塔假丝酵母发酵木糖生lignocellulose degradation products on ethanol fermenta-产乙醇的研究[门酿酒科技,2007,(9):45~46tions of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae,13黄文芳,张松微生物学试验指导[M]广州:暨南大Zymomonas mobilis, Pichia stipitis and Candida shehatae学出版社,2003.32~34[J]. 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Applied Microbiology and BiotechnolFermentation of hardwood hemicellulose hydrolysate byogy,1986,23:228~233Research on Fuel Ethanol Production from Palm ShellsWang Qiong,2, Zhuang Xinshu, Zhang Yu'Xu Mingzhong,2, Xu Jingliang, Li dong,2, Yuan Zhenhong1( Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences; Key Laboratory of Renewable Energy and Gas HydrCAS: The New and Renewable Energy Key laboratory of guangdong Province, Guangzhou 510640, China)2( Graduate School of Chinese Academy of sciences, Beijing 100039, China)aBSTRacT Compared with other cellulosic biomass from agricultural and forest residue, the ratio of cellu-lose in palm shells is rather high, meaning that the palm biomass has a good application prospect in the areaof fuel ethonal production. Choosing the high temperature liquid water hydrolysate and the cellulase hydrolysate from palm shells as fermentation materials, we studied ethanol production by using Cadida shehataeATCC 34887, Saccharomyces cerevisiae 2. 20251 and Saccharomyces cerevisiae. It was found that in compari-son with high temperature liquid water hydrolysis, the fermentation from cellulase hydrolysate has the advantage of simplicity and better efficiency, with the highest yield rate of ethanol of 70%. There are still manytechnical issues to be addressed in the fermentation from high temperature liquid water hydrolysate.Key words palm shells, fermentation, fuel ethanol中国煤化工CNMHG682008vo34No.9( Total249)