李品种的RAPD分析

第25卷第4期中南林学院学报Vol. 25 No. 42005年8月JOURNAL OF CENTRAL SOUTH FORESTRY UNIVERSITYAug. 2005[文章编号] 1000- 2502(2005)04-0046- 04李品种的RAPD分析.黄曙光'，乌云塔娜2*，谭晓风2.3(1.吉首大学师范学院生物系,湖南吉首416000; 2.中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室,湖南长沙410004;3.中南林学院资源与环境学院,湖南长沙410004)[摘要]从96条S系列RAPD引物中筛选出能稳定扩增并具有多态性的13条引物,对25个李品种进行了RAPD分析.结果表明，只用S17、S459和S1169等3条引物就能鉴别出所供试的25个李品种.利用PopGene软件中的UPGMA方法对供试25个李品种进行分子聚类分析,取LD=0.45,可将这25个李品种分为8类.[关键词]李; 品种; RAPD;分子鉴别;分子分类[中图分类号] S662. 3;Q523[文献标识码] ARAPD Analysis of Plum CultivarsHUANG Shu-guang'，WUYUN Ta-na', TAN Xiao feng2(1. Dept. of Biology, School of Normal, Jishou University, Jishou 416000，Hunan, China;2. The Key Lab. of Non- wood Forest Product of Forestry Ministry of CSFU, Changsha 410004. Hunan, China;3. School of Resources and Environment, Central South Forestry University, Changsha 410004, Hunan, China)Abstract: In this research 13 primers were selected from 96 random ones which could be success flly used for amplifying the DNA of25 plum cultivars and showing polymorphism. We could identify each cultivar by DNA fingerprints and the characteristic bands.Among them，the above- mentioned cultivars could be distinguished only with S17, S459 and S1169. In the same time 25 cultivarswere taken for cluster analysis by using the way of UPGMA and PopGene software, and when LD was 0. 45, the cultivars could beclassified into 8 categories.Key words : plum; cultivars; RAPD; molecular identification ; molecular classification李是蔷薇科李属PrunusL..植物,该属大约有30余种,分布于北半球气候温和的地带，其中我国有8种和4个变种,中国是李属植物的起源中心和分布中心之一.中国李原产于我国长江流域及西北一带,是我国栽培最早的果树之一,迄今已有3000年以上的栽培历史.目前,我国栽培的李属果树有8个种,800多个品种,其中,主要栽培的有中国李、日本李、杏李、櫻桃李、美洲李和欧洲李6个种,约100多个品种[1~5].我国李资源丰富,分布范围很广,在北纬21°00'~7220'之间李都能正常生长发育.但过去李栽培一直不被重视，管理粗放,产量低,质量差,经济效益远比不上苹果梨等大宗水果.近年来,随着人民生活水平的提高,对水果的多样化的需要,带动了小水果生产,尤其是国外优质李在国内水果市场.上卖价比苹果、梨高出数倍的比价效应,更是刺激果农发展李的步伐.近几年来,国外优良李品种大量引入国内,加上国内原有的品种，为李的发展提供了丰富的种质资源,但也由此带来苗木市场上的良莠混杂和品种不清的问题,特别是在国外李的引种栽培中,品种的命名比较混乱,同物异名现象十分严重6°].区| 中国煤化工态学方法外,近年来分子生物学的发展,特别是RAPD技术在品种鉴别和分类中的YHCNMHG统发育及资源保存提供了更为科学的依据[7.8].[收稿日期] 2005-05-27[基金项骨数家科技基础条件平台工作项目“林木种质资源标准化整理、整合及共享试点”(编号:2004BKA30400).[作者简介]黄曙光(1960- -),男,湖南吉首人,讲师,农学士.主要从事植物学教学和分子生物学科研.第4期黄曙光等:李品种的RAPD分析471材料与方法1.1材料实验于2003年3月~11月在中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室进行.供试的25个品种(见表1)采自吉首市无毒果树苗圃和中南林学院苗圃.1.2方法表125 个参试李品种及代号Table 1 Codes for 25 plum cultivars叶片DNA的提取采用改良的CTAP编号品种来源I编号来源编号来源法'9进行,提取的DNA样品经核酸蛋白检奥得罗达A116乐乐香B19李王测仪检测浓度和纯度达到要求后,置于奥李14 A| 1:安哥诺A2(奈李奥李71 A|1玫瑰皇后A21美国大李-20C下保存备用.PCR扩增采用15 μL大石早生B2) || 1:黑宝石A22盖县大李的反应体系,其中包括: Taq酶(5 U●大石中生F蓝宝石23衡山白糖李C早美丽| 15紫(黑)琥珀A24半苦李μL-1) 0. 15 μlL, MgCl2(25 mmol●L-I)总统皇家宝石A2麦李1.5 uL,10XPCR缓冲液1.12 uL, dNTP蜜斯李秋姬(10 mmol●LI) 1 μL,引物(16.5 ng●苹果李3)|1先锋uL-I) 1.3μL,模板DNA (10ng●μL-I)1)A表示为布朗李(美国为主)品种;2)B表示为日本品种;3)C表示为中国品种.1 pL,加入ddH2O使至终体积为15 pL. PCR试剂均购自上海生工. PCR反应在德国产9600型PCR仪上进行.反应程序参照程中平[8等:94 C变性2 min,36 C退火1 min, 72 C延伸2 min,1次循环;94 C变性1 min,36 C退火1 min, 72 C延伸2 min ,40次循环;94 C变性1 min,36 C退火1 min, 72 C延伸10 min,1次循环.扩增产物在质量分数为1.4%的琼脂糖凝胶上电泳分离,经EB染色后,在美国产BIORAD凝胶光密成像扫描仪上观察、照相,以2DNA酶切片段标准分子量标记为参照,确定各分子标记的分子量大小.扩增谱带按有(1)和无(0)记录，计算任意两个品种的相似系数,使用软件PopGene32中的二倍体分析程序,采用UPGMA方法,对25个李品种进行聚类分析.表2筛选引物的序 列2结果与分析Table 2 Alignment of selected primers引物名称序列2.1 RAPD-PCR 扩增.S17AGGGAACGAGS1168ACCCCCACACS21CAGGCCCTTCS1169GTGGTCCAGA从96个S系列的随机引物中筛选出13个S51AGCGCCATTGS1172GTCTTACCCC引物(见表2),对供试的25个李品种进行PCRS65GATGACCGCCS1173TGAAGCCCCT扩增.结果表明,选中的13条引物均可扩增出S167CAGCGACAAGS1178GTCGTCGACAS459GGTGCACGTTS1363GGCTGTGTGG谱带大小在200~2300 bp之间的片段,并在供S1161AACTGGCCCC试的25个李品种间存在高度多态性,图1是引物S1169的扩增产物DNA指纹图.2.2李品种的分子 鉴别.所筛选的13种引物,对参试品种进行RAPD-PCR扩增后,得到了13张DNA指纹图谱和154个位点上扩增出条带,其中多态性位M123456 7 8 9 1011 1213141516 M17 18192021223 M 2425点138个,多态性达89. 61%,每个引物扩增位图1 S1169中国煤化工故字对应品种编号见表1.M .点平均位11.85个.代表NMHCNMHG表3是利用13种引物对25个供试李品种Fig. 1 Amplification results of primer S1169 to the 25 plumcultivars (Numbers refer to the cultivars listed in table 1)的鉴别结果.由表3可以看出,每种引物均可鉴别出11~H舍号种,13种引物对25个供试李品种的分子鉴别效率在44%~84%之间.由表3还可知,筛选出.的任何-种引物均不能全部鉴定出所有的品种.选择不同的引物组合,可以鉴别出所有的供试品种,其中只用中南林学院学报第25卷引物组合S17、S459和S1169就可以鉴别出所有的供试品种,这说明分子鉴别的高效性和可用性.表3筛选的引物对25个李品种的鉴定结果Table 3 Identification results for the 25 plum cultivars by the selected primers引物可以鉴定的不能鉴定的鉴别效率不能鉴定的鉴 别效率品种的编号/91,5,7,8,9,10,12,13,1.4,5.6.7.8,9,10,2,3,11,14.S6515.16.17,18.19,20.2.3,11.14.24 .7:S167218.20,2421 ,22.23.2519,21,22.23,25 .1.2,4.5,6,7.8,9,1.3.4.6.7.8,9.10.2.5,11,17.S117311.12.13.14.15.17.3.10,16.18.24.2576S116112.13.14.15.19.20.24，;819,20,21 ,22.23,16,21,22,23,251.2.3.5.8.9.10,11.1.3.4.5.6,7 ,8.10，2,9,11,S45912,14,15.17,18,19,4.6,7,13,16,8(S116812,14,16,17,18，13,15,20,2520,21,22.23,24.2519,21,22,23,241,2,6,7,10,11,12，1,2,3.4,5.6,7,8.9,S1713,14.15.16,17,18，3,4,5.8.9,19.2072S116911,12,14,15,16,17.10,13,20,2121.22.23,24.2518.19,22.23.24.251,4,5.6.7.8,9，4,6.7.8,10,11，S2110.12.13.15.17.18.2,3,11.14,16.20S511.2.3.5.9.12.13,15.16.17.18，4414.19.21.24.2519,21 ,22 ,23,24,2520，22,23,2.4.5.6.7.8.9.10,1.4.5.6.7.8.9.10,S1172 .1,3.1,15,19,247S1 36311,13.16. 18, 19,2,3.12.14.12,13,14 16,17 ;18，11+13.16.18.19，15,17,21,24,20,21.22,23.2520,22.23.251.4,5.6.7.8,9,3,11,14,S117810,12.13+15，16,20,22.617,18,19,21.2324,252.3 聚类分析根据DNA扩增结果的统计分析,得到这25个品种间的遗传距离和相似系数,其中遗传距离为0.2432~0.8398,而相似系数在0.4545~0.7500之间.用遗传距离进行UPGMA聚类分析,构建了25个品种的遗传关系图(见图2).在LD=0.45处划等值线,可以将参试品种划分为8类:①奥得罗达、早美丽、李王、乐乐香、总统、蜜斯李、大石早生和大石中生;②玫瑰皇后、黑宝石、蓝宝石、紫(黑)琥珀;③秋姬、苹果李、盖县大李、衡山白糖李、美国大李和麦李;④安哥诺;⑤先锋;⑥奈李;⑦半苦李;⑧皇家宝石、澳李14和澳李71.0.80.60.40.223162420181125232221917 13151412548710196 1李晶种编号图225个李品种的RAPD聚类分析树状图Fig. 2 Tree diagram for 25 plum cultiv中国煤化工第①类虽都属于布朗李系列品种,但都具有中国基因、如CNMH和大石中生属日本李品种,日本李是从中国引入的;蜜斯李是中国李与樱桃李在新西三杂父育成;奥侍歹达1是由中国李和北美其他李杂交育成;总统则还含有欧洲李的基因.第②类的黑宝石是由美洲李Nubiana与来源不详的Guviota杂交育成的,Nubiana是由中国李和美洲李杂交后代育成的11;玫瑰皇后由安皇后与圣玫瑰杂交而来.紫(黑)琥珀是由黑宝石务移嫂暑后杂交而成，从聚类来看蓝宝石与黑宝石有较为紧密的亲缘关系.第③类都属中国李,但秋.姬是在日本育成的,美国大李是在美国育成的.第④类的安哥诺和第⑤类的先锋来自美国,其亲本不详.第⑥类第4期黄曙光等:李品种的RAPD分析19奈李是中国李的一个变种.第⑦类半苦李为中国李原生的比较古老的品种.第⑧类澳李14、澳李71和皇家宝石也属布朗李品种，但澳李14和澳李71是在澳大利亚育成,由于其含有中国李基因,通常又被划为中国李品种6.4~16];而皇家宝石原产美国,是否也含有中国李基因,有待进一步研究,从聚类可以看出它们似乎都含有相似的国外李基因.半苦李果小、味苦涩,没有商品价值,在当地处于半野生状态;奈李又是中国李的一个变种,它们各自成-类,没有与其他中国李聚在一起,是因为它们的遗传差距过大的缘故.李王、大石早生等日本品种是在日本育成的,澳李14和澳李71是在澳大利亚育成，由于亲本的长期隔离或栽培育种途径不同,其遗传基础与中国李的乡土品种比较已发生了很大变化;至于它们也不能聚为一类,很可能与其育种材料不同有关.其余品种主要为在美国育成的布朗李系列品种.布朗李系国外李的统称,但在分子分类中却不能聚为一类,这与布朗李品种的亲缘关系和来源复杂有关.就其亲缘关系来说,它融入了中国李、日本李、欧洲李、美洲李、杏李或櫻桃李等的基因,是通过上述物种的自然杂交或人工杂交选育而成的.从上可以看出,李品种尤其是国外李品种杂交的亲本来源十分复杂,至今仍不清楚，有待深入研究;但从本研究来看,有不少布朗李品种含有中国李的基因,尤其是日本品种与中国品种之间的亲缘关系很近.3结.论(1)本实验从96种随机引物中筛选出13种多态型引物,可用于李品种的多态性研究和分子鉴别.(2)对25个李品种的RAPD分析结果表明,李品种间的遗传多态性很高,达89.61%;并建立了这25个品种的指纹图谱,用不同的引物组合、结合品种特征带可以鉴别所有的参试品种,为李品种的登录、分子分类和分子鉴别提供了-定的科学依据.(3)根据RAPD分析结果对参试的25个品种进行的聚类分析,聚类结果基本符合各品种之间的亲缘关系,为这些品种进-步遗传改良提供了选配育种亲本的依据.[参考文献][1]俞德浚.中国果树分类学[M].北京:农业出版社,1979.[2] 俞德浚.落叶果树分类学[M].上海:上海科技出版社.1984.[3]吴耕民.中国温带果树分类学[M].北京:农业出版社.1984.[4]中国农 业科学院果树研究所.果树种质资源目录(第-集)[M].北京:农业出版社,1993.张加延,孙升.中国李杳资源及开发利用研究[M].北京:中国林业出版社,000.6.[6] 张建国,何 方.我国李的引种栽培及研究概况[J].河北果树,2003(3):1-3.[7]谭晓风.胡芳名.张党权,香榧主要栽培品种的RAPD分析[J].园艺学报,2002,29(1):69-71.谭晓风,胡芳名，张启发.银杳主要栽培品种的分子鉴别[J].中南林学院学报,1998,18(3):1-8._9]谭晓风,漆龙霖，黄晓光，等.山茶植物叶片DNA提取[J].中南林学院学报,1999,19(4):78-81.[10]程中平 ,陈志伟,胡春根,等.黄肉桃种质资源的RAPD分析[DJ].遗传.2003.25(1):49-56. .[11] 阮颖,周朴华,刘春林.9种李属植物的RAPD亲缘关系分析[J].园艺学报，2002 ,29(3) :218- 223.[12]程中平. 利用分子标记对桃、李杏、梅、櫻类植物系统发育的分析[J].中国南方果树，2003 ,32(3):45- 50.[13] 乔玉山,章 镇,房经贵.等.中国李RAPD的优化反应体系及其在品种鉴定中的应用[J].果树学报, 2003.20(6):445- 449.[14]朱立武.李树种质资源抗性生理指标的研究[J].园艺学报.2002(13):395-398.[15]杨剑,涂炳坤,唐旭蔚,等.-种与板栗嫁接亲和性高的茅栗居群及其RAPD分析[J].经济林研究.2005.23(1):24-27.[16] 张日清,吕芳德,谭晓风， 等.美国山核桃主要栽培品种的RAPD鉴定[J].经济林研究,2004,22(4):1-5.中国煤化工E本文编校:邱德勇]MYHCNMHG