聚乙二醇处理对羊草种子萌发及活性氧代谢的影响

第!1卷第1期Val11.N.1mACTA PRATALLfUKAE SINICA8/2002聚乙二醇处理对羊草种子萌发及活性氧代谢的影响刘杰,刘公社" ,齐冬梅,李芳芳,汪恩华(中国科学院櫝物研究所.北京11093)摘要:应用聚乙二醇(PEG 600)引发法探讨了不同引发渗透处理时间处理对羊草种子萌发及活力的影响，结果表明:以30% PEG处理羊草种千24 h.能显著提高羊草种子发芽率和幼苗活力降低萌发过程中的外渗电导率。在羊草种子萌发期间,经PEG处理的羊草种子.呼吸速率初始低千对照,之后迅速增加;超氧负离子(O2- )浓度明显降低.超氧化物歧化酶(SOD)相过氧化物酶(PO0D)的活性均显著增加:脂质过氧化产物内二醛(MDA)的积累最明显低于对照。经PEG引发引起的羊草种子活力升高与体内活性氧代谢的变化存在着定的内在联系。关键词:聚乙二醇(PEG);活力指数;活性氧代谢;羊草种子中围分类号:S543.903.7文献标识码:A .文章编号:1004- 5759<2002)01 0059-06羊草又称碱草(Leymus chinensis) ,是禾本科牧草之王,我国约占世界羊草总面积的一半,主要分布 于东北平原、内蒙古高原的东部和中部、华北北部山区、黄t高原。羊草具有蛋白含量高、适口性好、适应性强、产草量高等特点，牛、羊均喜食，素有“牧草中的细粮”之称1。羊草草地是优良的天然放牧地和割草地,在目前北方草原改良和人工草地建设中.已成为大面积种植的主要优良牧草,在当前发展草原畜牧业、改善西部生态环境等方面具有举足轻重的地位。因此,加大科研投入,采用生物技术手段全方位开展对羊草的科学研究,已引起政府和越来越多研究者的关注(2.2]。由于羊草的人工驯化时间较短,野生性较强,使得羊草的结实率、发芽率、产草量偏低的“三低”问题长期得不到很好地解决,成为限制草原改良和人工草地建设的“瓶颈”。近年来,虽有一些研究报道了对羊草种子休眠机理及种子发芽特性钓探讨15.6.但仍缺E近-步的研究资料。本试验采用渗透调节剂聚乙二醇PEG-6000引发羊草种子,测定种子萌发过程中过氧阴离子(O2-)的含量、脂质过氧化物产物丙二醛(MDA)的积累,分析膜透性及有关活性氧清除酶的变化,对在渗透调节作用下羊草种子萌发过程中括性氧代谢与其相关酶类的活性和幼苗活力之间的内在联系进行了初步研究,旨在阐明PEG引发对促进羊草种子萌发和活力的效应,为解决羊草“三低”难题提供理论依据。1材料与方法1.]试验材料供试羊草种子1998 年采自中科院内蒙古多伦县草原站。1.2渗 透处理配制5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%的PEG-6000浸润种子，置于14 C培养箱中避光处理10 h后，用蒸馏水冲洗3~4次,置于滤纸上10 min,自然风千。然后将羊草种子置于培养皿滤纸上,放入培养箱中20/30 C变温(8 h高温,16h低温>黑暗条件下萌发,萌发过程中保持水分。每组200粒种子,3个重复。逐日观察统计发芽情况。10d后检测幼苗活力指数[幼苗活力指数=(胚根长+下胚轴长)X发芽率]。根据最高活力指数的PEG浓度对羊草种子进行3.12.16.20.24.36、48 h的浸润处理,筛选出24 h处理时间与30% PEG-6000渗透引发为最佳处理条件。再用30%PEG-6000处理羊草种子24 h后,进行萌发实验，分别取萌发4d.5d、6d.7d、中国煤化工8d.9d、10d的幼苗为材料,进行下一步的生理生化指标的测定。MHCNMHG收稿日期:200 07-03作者简介:刘杰(1963-).男、河北来定人，博士,副研究员。*通迅作者50ACTA PRATACULTURAE SINICA(Vol. 11,No. 1)3/20021.3测定方法经PEG预处理的各组羊草种子,用蒸馏水洗干净后,取重量-致的萌发种子(1. 34 g.500粒),在25 ml重蒸水中萌发,分别在4.5.6.7.8.9、10 d时测定种子外渗电导串,3次重复。外渗电导率的测定参照陈光仪的方法[”;呼吸速率的测定参照碱吸收法,25C时测定萌发种子呼吸释放的CO,含量f°8];超氧阴离子的测定参照王爱国等.的羟胺法[";过氧化物酶(POD)活性的测定按波钦诺克的方法[0];过氧化物歧化酶(SOD)活性的测定,采用氮蓝四唑(NBT)光化还原抑制法"”;丙二醛(MDA)含量的测定,按Heath 等的硫代巴比妥酸(TAB)比色法”。2结果与分析2.1 PEG 处理对羊草种子活力的影响用不同浓度PEG、不同时间处理的羊草种子萌发率及幼苗活力指数均高于对照,其中以30%PEG处理24h的羊草种子差异最为显著(表1、2),发芽率可提高4倍左右,而活力指数提高了近10倍。表1不同PEG浓度处理对羊草种子萌发率及幼苗活力指数的影响Table 1 Effect of difterent PEG concentration on the vigour index in wildrye seeds项目ltemCK10% 15%20%25%30%35%发芽率Rate gerninatioa (%)11.20 24. 6029.400 35.800 39.200 46.700 56.500 55. 400胚根+胚轴长Length of radicle and pocotyl (cm)2.120 2.440 2. 9803. 2603. 1203.440 3. 8803. 210活力指数Vigour index0. 2370. 6000.876 1.167 1. 2231.6062. 1921.778表2 30%PEG 浓度不同时间处理对单草种子萌发率及幼苗活力指数的影响Table 2 Effect of different PEG concentratioo and time on the vigour index in wildrye seeds项目1lem12h16h20 h24h 36h 48 h发芽事Rate germination (%)11.400 35.600 38.200 40.500 42.400 58.800 53.600 54. 100胚根+胚轴长Leagth of radicle and pocotyl (cm)1.980 3.140 3.100 3.210 3. 2203.850 3.680 3. 530括力指敷Vigour index0.225 1.1181.184 1.300 1.365 2.264 1 9721. 9102.2 PEG处理对外渗电导率的影响不同浓度PEG处理24 h的羊草种子,置于蒸馏水中萌发,萌发过程中其外渗电导率较对照均有明显下降，以30%PEG浓度处理组最小(图1)。以30% PEG依度对羊草种子进行不同时间处理,在萌发过程中的外渗电导率随处理时间的增长而逐渐减小。处理时间大于24 h的实验组,虽外渗电导率仍在下降,但幼苗活力指数却有所降低(表2.图1),可能是由于PEG处理控制了水分渗透势,过分限制了水分进入种子内部,从而影响萌发进程。.3 30%PEG预处理24h对羊草种子呼吸和O2~含量的影响羊草种子在萌发过程中呼吸代谢逐步加强，以每mg蛋白CO2释放量计的呼吸速率第9d达到最大值。经30%PEG处理的羊草种子呼吸速率增加的速度明显大于对照,第7d时已接近对照组(图3)。随着羊草种子萌发过程中呼吸强度的逐步增加，细胞内0;离子含量呈逐步升高的趋势，第8d达到峰值，表现出与呼吸强度变化的密切相关。而经PEG处理的羊草种子,其02含量虽也增加,但增加速度明显降低,到第7d的O2-含量仅为对照的48.6%(图4)。测定结果表明PEG处理可有效降低种子萌发过程中O2~自由基的积累。中国煤化工2.4活性氧清 除酶活性的变化超氧化物歧化酶(SOD)作为植物体内抗氧化酶体系的关MH. CNMHG2O;自由基。使用邻苯三酚自氧化法")和肾上腺自氧化法测定[*ISOD活性时,由于羊草叶子粗提液中多酚氧化酶的干扰,很难达到理想效果。采用氮蓝四唑光化还原抑制法，能够避免多酚氧化酶的不利影响。酶活性的计算以对NBT光化还原第11卷第1期草业学报202年6|的抑制率作为标准,50%抑制率为一个活性单位。图5的结果表明:测定初始PEG处理组与对照S0D活性几乎在同一水平,以后随萌发时间的增加,SOD活性逐渐升高,第8d达到最高水平,与对照相比较,处理组SOD活性明显高于对照,峰值时是对照的1.44倍。700+cx母5强七15*-20+35%0 10%600700 十25%一 30%里500，5004040030员300200希200P 100中100cK 81216 20 236 48时间Time油)时间Time (h)图1不同浓度PEG处理后羊草种子围2不同时间30%PEG处理后对萌发过程中外渗电导率的变化浸泡10 h羊草种子电导率的影响Fig. 1 Change of conductivity of wildrye seed germinating Fig. 2 The conductivity of wildrye seed in 10 h marioatingwith different concentration of PEG treatmentafter treatment in different time with 30% PEG←CK甘30%PEG士-CK一30%PEG0.8置3E20.40.2;561891010萌发时间Time (d)图3羊草种子萌发过程中呼吸强度的变化图4羊草种子萌发过程中O2 -的变化Fig. 3 Cbange of respiratory intensityFig.4 The content ofO2 inof wildrye seeds during germinationwildrye seeds during germination◆30%PEG七CK+ 30%PEG -0-CK500京3400光e300东e200家100中国煤化工9 10MHCNMH G图5羊草种子萌发过程中 SOD活性的变化图6羊草种子萌发过程中POD活性的变化rig.5 Activity of SOD in widrye seeds during germinationFig. 6 Activity of POD in wildrye seeds during germination62ACTA PRATACULTURAE SINICA(Vol. 11,No. 1)3/2002过氧化物酶(POD)是植物体内另一种淯士30%PEG母CK除括性氧的重要酶类。测定结果表明:在羊草种25 f子萌发初期,细胞内P0D活性急剧升高,第8d时达到峰值。与对照相比,经PEG处理后的羊20草种子,其POD活性升高幅度明显大于对照，o一6d后的POD活性是对照的1.24倍(图6)。PEG处理能有效诱导SOD与P0D活性氧清除酶的活性升高。2.5丙二醛(MDA)含董的变化植物细胞膜系统的主要组成成分是脂质和萌发时间Time (d)蛋白质。脂质氧化产生的自由基可使膜质过氧图7羊草种子 萌发过程中MDA含量的变化化而造成细胞膜损伤。丙二醛(MDA)是脂质过Fig.7 Change of the content of MDA in氧化反应的产物，与自由基活性氧的含量关系wildrye seeds during germination密切,其形成的速率在一定程度上反应机体内清除自由基能力的大小和活性氧代谢的水平1s]。图7的结果表明:羊草种子萌发过程中MDA的含量呈增高的趋势,用PEG预处理羊草种子可降低脂质过氧化反应。3讨论羊草种子休眠时间为4年左右,且发芽时间长,成活率低。有些研究报道了采用磁处理.低温流水浸泡、激素处理等方法可打破羊草种子休眠并对提高种子发芽率有一定作用5.162。聚乙二醇(PEG)是较为理想的渗透调节剂,PEG处理在大豆、高粱、水稻、蔬菜、花生等作物种子上都表现出明显效果"”1。在禾本科牧草研究上,也有一些PEG处理种子的研究报道。国外学者多采用低渗透势、长时间对种子进行处理,而国内研究人员则多倾向于高渗透势、短期的处理!0]。本实验的结果表明:用30%的PEG处理24 h后的羊草种子,在提高发芽率、发芽势、种子活力等方面,效果也很显著(表1、2)。植物体内的活性氧(AOS)对植物幼苗、细胞结构与功能、生物大分子、酶系统、DNA均有一定的伤害作用02]。AOS是生物体进行氧化还原反应时发生的电子渗漏,渗漏的电子与O2结合而产生。当体内活性氧清除酶量不足或活性太低时，就会有活性氧积累。逆境诱导也会引起植物体内活性氧增加，由此产生的氧化胁迫导致植物的不可逆损伤。然而,植物在长期进化过程中,形成了一个完善的清除氧防卫系统,使植物体内产生与清除活性氧维持在一个动态平衡。当该动态平衡被破坏,植物的结构与功能就可能受到损伤甚至出现死亡。随着自由基生物学的发展,特别是超氧化物歧化酶的发现,使得对植物体内重要调节保护机制一抗氧化酶 系统的研究日渐深入221]。研究发现:在种子萌发过程中氧自由基会对质膜、酶系统、蛋白质合成造成一定的伤害作用,使种子发芽率降低。SOD活性与种子活力密切相关,在种子人工老化处理后的吸涨萌发过程中,SOD活性比对照不仅低且出“晚“3]。羊草种子经30% PEG处理24 h后,活力指数比对照高出近10倍.萌发过程中O2含量降低显著，而MDA的积累仅为对照的60%左右.SOD、POD抗氧化酶的活性与对照相比有明显增强。萌发期间的外渗电导率明显低于对照,而呼吸速率的增加则明显高于对照。因此,PEG处理对羊草种子萌发过程中活性氧自由基引起的过氧化反应起到一定的抑制作用,从而提高种子发芽率和幼苗活力。PEG引发是通过引发溶液的渗透压来达到引发种子的目的。其实质是限制水分进入种子的速率,减少种子吸涨过程中膜系统的损伤,也有利于膜系统损伤的修复[24。Rich(1978)研 究发现:在种子萌发过程中,如果线粒体内膜损伤减小,呼吸电子传递链上NADH-黄素蛋白和辅|中国煤化工减少,就会降低O2~形成的速率，并引起外渗电导率的降低(2]。植物SOD是一:DHCN M H G外部环境条件可影响.SOD活性水平。在某种意义.上,PEG处理对种子萌发来说,起到是一种水分胁退的作用，如果这种胁迫是在植物体耐受范围之内,便会激活体内包括抗氧化酶在内的一系列保护机制的启动16]，从而引起机体内抗氧化活动的第11卷第1期草业学报2002年53增强，加速活性氧自由基的清除,减低对种子萌发过程中的不利因素,提高种子活力水平。銬文献:[1]贾慎修. 中国饲用植物志(I)[M].北京:中国农业出版社,1987.19-35.[2]刘公社.王 志远.北方农牧交锴带可持续发展论文集[C].北京:中国科学技术出版社:1999.[3]刘杰,刘公社,齐冬梅,等. 用徼卫星序列构建羊草遗传指纹图谱[].植物学报200.42(9):985-987.8[4]武保国,权宁玉. 羊草种子发芽特性的研究[J].牧草与饲料1992,(1):16-18.[5]易津. 羊草种子的休眠生理及提高发芽率的研究[].中国草地,1994,(6):1-6.[6]赵传孝, 杨根风,张国瞳,等.羊草种子发芽率的研究[]，中国草原，1986,<5):54-56. .[7] 陈光仪,傅家瑞. 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During germination peri-od，although the respiratory intensity of wildrye seeds pretreated with 30% PEG for 24 h was lower at begin-ning , it increased rapidly soon afterward; the content of O:- decreased visibly but the activity both of superox-ide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) increased. The accumulation of malondialdehyde (MDA) wasmuch lower than that of control. Consequently, it suggested that there was some interacting relationship be-tween the increasing of vigour index through pretreatment with PEG and the increasing of activity oxygenmetabolism.Key words: activity oxygen metabolism; PEG; vigour index; wildrye seed中国煤化工MHCNMHG