河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定

2007年第10期河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定吴兴泉,陈士华,陈涛,薛 珍,娄玉华(河南省谷物资源转化与利用重点实验室,河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001)摘要:利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY )进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物，以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT- PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系pl基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY pI基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。关键词:河南省;马铃薯Y病毒; RT- PCR;检测与鉴定中图分类号: S435. 32文献标识码: A文章编号:1004 - 3268(2007)10- 0064 - 03The Molecular Detection and Indentification ofPotato. Virus Y in Henan ProvinceWU Xing- quan, CHEN Shi-hua, CHEN Tao, XUE Zhen, LOU Yu-hua(The Key Laboratory of Grain Transformation and Utilization of Henan Province,College ofBioengineering,Henan University of Technology , Zhengzhou 450001 ,China)Abstract:Potato virus Y (PVY) can infect potato and do harm to potato seriously. The PVY inZhengzhou city and Xinyang city of Henan province was detected and identified by RT- PCR mo-lecular detection technology. The spencific primers PVYP1 and PVYP2 were designed based onpVY p1 gene, which amplified a DNA fragment of 0.58kb by RT- PCR using the RNA from theinfected plant by PVY as template. However, no DNA fragment was amplified from RNA ofhealthy potato. The PCR product was sequenced. The results of Blast analysis showed that thesimilarity of the sequence with the pl gene of PVY strain N:O reached to 99%, indicating thatthe PCR product is the partial DNA fragment of PVY pI gene. Then the RT - - PCR detectionmethod of PVY was established. The detection method was improved by shortening the reactiontime ,and optimizing the PCR procedures and PCR reagent system.Key words: Henan province; Potato virus Y; RT- RCR; Detection and indentification我国是马铃薯生产大国,马铃薯种植面积和总从北部发病轻的地区调种。建立快速、准确的马铃产量都位居世界第一,河南省马铃薯种植面积也在薯病毒检测技术是保证种薯安全调运和种薯成功脱不断增加。但单产比世界平均单产低,单产水平与毒的关键,对马铃薯的有效防治具有重要的现实发达国家相比差距更大。马铃薯病毒病是马铃薯意义4。单产低的重要原因之- -.马铃薯Y病毒(potato vi-河南省属于中原二季作区,马铃薯病毒侵害比rus Y, PVY)是马铃薯上非常重要的一种病害[2]，我国西部和北部地区严重,而关于河南省马铃薯病可导致马铃薯退化，降低产量,严重时减产可达毒的危害情况尚未见全面的分析报道[5。为明确河80%以上问。在我国由北向南马铃薯带毒率逐渐增南省马铃薯Y病毒的发生情况,建立马铃薯病毒的高，造成我国中部和南部地区不能自行留种,必须快速、准确、灵敏、特异的分子检测与鉴定技术,开展中国煤化工MHCNMHG收稿日期:2007-07 -24基金项目:河南省教育厅自然科学基金项目(2006210003);河南工业大学校基金项目作者简介:吴兴泉(1970-),男,黑龙江克山人,副教授,博士,主要从事分子生物学与植物病理学研究。●64●河南农业科学了本项研究。PCR反应程序为:94C预变性10min,然后94 C变性1 min,37 C退火1min,72 C延伸1 min,1材料和方法共进行30个循环,然后72C延伸10 min.1.1 试剂1.3.2.4 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测取植物总RNA提取试剂盒(TianGen),5X M-PCR产物2. 5μL,6 X Loading Buffer ( TaKaRa)MuLV反转录酶缓冲溶液(Promega),dNTPs1μL,琼脂糖凝胶[1(凝胶浓度1.0%,TAE缓冲体(TianGen), RNasin inhibitor ( Promega), M-系),进行电泳分离,EB染色后,在长波紫外光下MuLV反转录酶(Promega), 10 X Taq Reaction Bio- RAD凝胶成像仪采像。buffer( TianGen), M - MLV RT5 X Buffer(Pro- 1.3.2.5 序列测定与分析对所获得的 PCR产物mega) ,Taq DNA Polymerase(TianGen) ,6X Load-直接送至北京三博远志生物工程有限公司进行ing Buffer(TaKaRa), D2000Marker( TianGen),引DNA序列测定。DNA序列采用Blast和Clustal X物是由大连宝生物有限公司合成,DNA胶回收试剂进行分析。.盒(大连宝生物有限公司)。2结果与分析1.2 马钤薯病毒样本的采集2007年5月1日和5月6日分别依据马铃薯2.1马铃薯病毒样本的采集结果植株发病症状在郑州市古荥镇和信阳市平桥区采集在郑州市古荥镇和信阳市平桥区马铃薯产地采.马铃薯病毒样本。集PVY样本,发现马铃薯田间病毒病主要有:矮化、1.3 PVY RT- :PCR 检测方法的建立束顶、卷叶.花叶4种症状。采集具有明显马铃薯病1.3.1植物总RNA的提取使用植物总 RNA提毒病症状马铃薯叶片带回实验室进行分子鉴定。取试剂盒提取带病马铃薯和健康马铃薯叶片总2.2 PVY RT- PCR检测技术的建立RNA,具体方法依照说明进行。RNA溶液保存在首先对郑州市带病马铃薯样本进行了检测，以.- 20C冰箱中备用。健康马铃薯样本为对照。采用RT- PCR法扩增1.3.2 RT- PCR扩增p1基因片段PVYp1基因中581bp长的cDNA片段(图1)。从1.3.2.1引物的设计与合成从Gen Bank中获图1可以看出,RT- PCR扩增产物与预期大小一得PVY p1基因全序列,利用Clustal软件分析明确致,而健康对照无此扩增产物。利用上述方法对信其主要保守性区,设计引物序列为:上游引物PV-阳市 马铃薯病毒样本进行检测，也得到相同结果。YP5:5'- CGATACAAGACTGATGTCC-3'(与证明利用引物PVYP5,PVYP3采用RT- PCR技p1基因的第397bp至426bp间序列同源),下游引术可实现PVY的准确鉴定。物PVYP3序列为: 5'一TTCATGCGATCCACG-CACT- -3 (与pI基因第959bp至978bp间序列互2000bp .补)。引物的合成在宝赛生物科技有限公司。1.3.2.2反转录[6] 取一 Eppendorf管,加人马铃00p0薯总RNA 5μL,引物PVYP3 1 pL, ddH2O 4pL,750bp95C下变性10min,立即取出置于冰上放置5 min.500bp再依次加人:5X M- MuLV反转录酶缓冲液5μL,40 mmol/L dNTPs(每种10 mmol/L)1 μL, RNasin250bp(40U/uL)1μL,M一MuLV反转录酶(20U/pL)100bp1μL,加人DEPC处理过的ddH2O 7μL.将反应混合物于37 C水浴1h,95C灭活5min,- 20C保存1.带病马铃薯; 2.健康马铃薯; 3. DL2000 Marker备用。中国煤化工Y病毒1.3.2.3聚合酶链式反应[0] 采用 25μL反应体2.MHCNMHG定与分析系进行,反应混合物包括cDNA 2. 5p儿L,引物各则龙刃吊朴信阳巾与管署件本中RT- PCR 扩2.5μL, dNTP 1. 0pL, 10X buffer 2. 5μL (含增产 物直接进行序列测定,PVY郑州分离物p1基MpCl), Taq酶0. 5μL, ddH20 13. 5μL。因片段序列如下:，65●2007年第10期GCGAGGAAGAGAAGAGAGGAATATAATTTCCAAATGGCTGCGTCAAGTGTTGTGTCGAAGATCACTATTGCTGGTGGAGAGCCACCTTCAAAACTTGAATCACAAGTGCGGAGGGGTGTCATCCACACAACTCCAAGGATGCGCACAGCAAAAACATATCACACGCCAAAGTTGACAGAGGGACAAATGAACCACCTTATCAAGCAGGTGAAGCAAATTATGTCAACCAAAGGAGGGTCTGTTCAACTGATTAGCAAGAAAAGTACTCATGTTCACTATAAAGAAGTTTTGGGATCACATCGCGCAGTTGTTTGCACTGCACATATGAGAGGTTTACGAAAGAGAGTGGACTTTCGGTGTGACAAATGGACCGTTGTGCGTCTACAGCATCTCGCCAGGACGGACAAGTGGACTAACCAAGTTCGTGCTACTGATCTACGCAAGGGCGATAGTGGAGTTATATTGAGTAATACTAATCTCAAAGGAAACTTTGGGAGAAGCTCAGAGGGCCTATTCATAGTGCGTGAPVY信阳分离物pI基因片段序列如下:CGCGAGGAAGAGAAGAGAGGAATATAATTTCCAAATGGCTGCGCCAAGTGTTGTGTCGAAGATCACTATTGCTGGTGGAGAGCCACCTTCAAAACTTGAATCACAAGTGCGGAGGGGTGTCATCCACACAACTCCAAGGATGCGCACAGCAAAAACCTATCACACGCCAAAGTTGACAGAGGGACAAATGAACCACCTTACCAAGCAGGTGAAGCAAATTATGTCAACCAAAGGAGGGTCTGTTCAACTGATTAGCAAGAAAAGCACCTATGTTCACTATAAAGAAGTTTTGGGATCACATCGCGCAGTCGTTTGCACTGCACATATGAGAGGTTTACGAAAGAGAGTGGACTTTCGGTGTGATAAATGGACCGTTGTGCGTCTACAGCATCTCGCCAGGACTGACAAGTGGACCAACCAAGTTCGTGCTACTGATCTACGCAAGGGCGATAGTGGAGTTATATTGAGTAATACTAATCTCAAAGGAAACTTTGGGAGAAGCTCGGAGGGCTTATTCATAGTGCGGG利用Blast分析软件分析,结果表明:PVY郑州技术可实现PVY的准确鉴定。分离物和信阳分离物的pI基因序列与PVY N:O2)河南省马铃薯种植区中郑州市马铃薯的株系的序列相似性均可达到99%,说明所得DNA PVY 带毒率高,信阳市马铃薯带毒率低。片段确为PVY p1基因。利用此对引物对带毒样本3)河南省马铃薯所感染的PVY与PVY N:O可扩增得到0.58kb的PVY pI基因片段,而健康马的基因序列相似性 极高,说明该病毒应为PVY N铃薯样本无此片段出现,因此,可用于PVY的准确株系[”。检测与鉴定。4)采用优化的PCR反应方案可实现PVY的2.4 PCR 检测方法的改进与应用快速、准确检测,且成本低廉。为缩短PVY RT- PCR检测技术所需时间及参考文献:试剂的用量,对反应程序进行了修改。具体如下:首[1] 魏延安.世界马铃薯产业发展现状及特点[J].世界农先,将反应循环中的变性时间和退火时间缩短为业，2005(3) ,29-32.30s,并将循环次数减为25次。其次,将反应循环[2]谢联辉,林奇英,吴祖建. 植物病毒名称及其归属[M].中的退火由37 C提高到47 C,再将PCR反应试剂北京:中国农业出版社, 1999:137-142.中除cDNA外的其他试剂按比例预混进行PCR扩[3] Hooker WJ.马铃薯病害及其防治[M].石家庄:河北增试验时,按cDNA:混合试剂=1+9混合取样进科学技术出版社，1992:129- 131.行,总反应体积由通常的25pμL降至10μL.上述改[4] 吴兴泉,陈士华,吴祖建,等. 分子生物学技术在马铃薯病毒检测中的应用[J].中国马铃薯, 2003(3) :175-进均可达到良好的PVY检测效果。此改进措施可节省PCR反应时间40 min,得到了更高的检测特异[5] 高凯,赵爱菊 ,刘忠玲,等.洛阳市马铃薯二季作区病毒性,试剂用量更少,成本更低。侵袭状况调查[J].河南农业科学,2002(9);33-34.利用此方法对来自河南省郑州市和信阳市的马[6]吴兴泉. 福建马铃薯病毒的分子鉴定与检测技术[D].福州:福建农林大学,2002. .铃薯样本进行了检测,结果表明,郑州市马铃薯样本[7] Weilguny H, Singh R P. Separtion of Slovenian iso-带毒较高,发病率可达20%以上，信阳市马铃薯样lates of PVY (NTN) from the North American iso-本带毒率较低,在田间仅有零星发生。分析其原因lates of PVY(N)by a 3-primer PCR[J]. J Virol Meth-ds,1998,71(1):57- 68.可能是因为信阳市的马铃薯种薯是从黑龙江省引进的,其种薯带毒非常低导致田间发病率也较低。中国煤化工3结论MHCNMHG1)利用引物PVYP5,PVYP3通过RT- PCR●66●