聚乙二醇修饰重组人天冬酰胺酶的研究

第15卷第2期:32生物技术Vol. 15,No.2:322005年4月BIOTECHNOLOGYApr.2005子对酶具有- -定的抑制作用。参考文献:3结论[1]Bemard P 0 H,Andrew M H, David J B, a al. Crystal structure of gycyl3.1经Macro- Pep High s Support离子交换层析得到很多洗endopeptidase frome Carica papayu:a cysteine endopcpidase of unusual sub-脱峰,其中洗脱峰5为木瓜凝乳蛋白酶,经SDS- PAGE电泳检strate peifcit[J]. Biocbeniltry, 1995,34:13190- 13195.[2]Eugene J, Norby M D, Manucher J M D.Cninuing expeience with chy测,其已达到电泳纯。3.2该酶在37C保温 24h后其活力丧失来只有原来的7.mulelyi[J]. The Mount Sinai Journal of Medidne, 20067(0):31-15% ,0.2%(m% )的Na*和0.02mol/L的Ca2*对其有明显的激313.[3][德]B. 施特尔马赫著.钱嘉渊译.酶的测定方法[M].第1版.中活作用。低浓度的K*、Cu?*对其也有激活作用。国轻工业出版社, 192.242 - 255.聚乙二醇修饰重组人天冬酰胺酶的研究郭桥' ,姜春懿3 ,张淑子3 ,李文波' ,吴永革2* ,李惟?(1.长春生物制品研究所，吉林长春130062;2.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012;3.吉林亚泰(集团)股份有限公司药物研究与开发中心,吉林长春130033)摘要:天冬酰胺酶对治疗急性淋巴细胞白血病和某些肿瘤疾病有很好的疗效,但由于其在人体内所产生的副作用一过敏反应限制了它的应用。目的:运用化学修饰剂聚乙二醉对天冬酰胺酶进行化学修饰,以降低其免疫原性,提高其在体内的半衰期;并使修饰后的天冬酰胺酶的活性保持较高的水平。结果:修饰后的天冬酰胺酶的免疫原性降低为原来的20- 30% ;用胰酶水解24h没有变化;而其比活力为未修饰酶的23%。该结果已经具备了很大的临床应用价值。关键词:天冬酰胺酶;化学修饰;白血病;聚乙二醇...中图分类号:Q812文献标识码:A 文 章编号:1004- 31(2005)02 -0032 -04Studies on the Recombinant Human Asparaginase Modified with Polyethylene GlycolCUO Qiao' ,JIANG Chun - yi ,ZHANG Shu- zi ,L Wen- bo' , WU Yong- ge?* ,LI Wei(i. Changchun Istitute of Biologial Products ,Changchun 130062;2. Life Science College of Jjlin University,Changhum 130012;3. R&D Center of Jini Yahai Co. Ltd,Changchumn 10033,.R. Chin)Abstract: Asparaginase shows good curative lfet on acute lymphoblastice leukemia and somne tumor ilneesese. But in vivo the side efet - llegeylinits its clinical aplication. Asparaginse was modified by activated PEG2 in the presence of substrate protection. The inmunogenicity of the mod-ifed enzyme was decreased to 20 - 30% of that of unmodifed enzyme. No proteolysis was found afer trypsin was added.It' S residual enzyme a8C~tivity was 23% . The result shows a very good potential value on clinical application.Key wrdsapagigiasdife;limphoblasti leukenia;PBG2天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺,是-种重要的抗癌药物。物天冬酰胺对其进行了保护,再用活化的PEC2对天冬酰胺酶20世纪60年代发现一些白血病细胞缺少天冬酰胺合成酶，因进行修饰,然后,对修饰前后的酶的一些性质进行了测定和比而不能产生一定数量的此种重要的氨基酸以维持细胞的生存较,结果,在降低了其免疫原性和延长了其半衰期之前提下，能力,因此,左旋天冬酰胺酶对治疗急性淋巴细胞白血病有很使其残余活力达到23%,大大扩展了该种治癌药物的应用前重要的帮助"。目前,左旋天冬酰胺酶已经与氨甲喋呤、阿糖景胞苷(Cyarbine)一起被用于白血病的治疗1口]。但是,限制左材料和方法旋天冬酰胺酶治疗作用的主要障碍是强烈的过敏反应,此外，1.1 材料使用后产生的中和抗体和血液中的蛋白酶的水解大大降低这1.1.1实验材料种药物的半衰期也限制了它的应用。解决上述的问题的方法单甲氧基聚乙二醇、氛尿酰氯荧光胺L-谷氨酸草酰乙酰氨之一就是对天冬酰胺酶进行适当的化学修饰。基转移酶(COT)、天冬酰胺酶购于Sigma Co. Lld; Sephacryl S-用高分子化学修饰剂对蛋白质和肽类分子进行化学修饰200 high resolution 购于Pharmacia Co. Ld;L-苹果酸脱氢酶已经成为生物技术与生物医学领域的研究热点，在众多的高(MDH)购于AMRESCO Co. Ld; BCA试剂盒购于Pierce Co. Iud; .分子化学修饰剂中,以线性的、无毒的、无免疫原性的和具有其它试剂均为市售分析试剂;巴比西鼠( Balb/c)购于长春生物双歧性聚合物性质的聚乙二醇(PEG)对蛋白质的化学修饰最制品研究所;羊抗鼠二抗购于.上海生工公司。引人关注'。PEG可以连接到天冬酰胺酶上与活性位点无关的其他位点上，隐蔽了该酶的抗原表位,降低其免疫原性(。,0-(CH2CH2O) -CH;PEC还可以防止网状内皮系统对天冬酰胺酶的吸收,从而大CH(CHC1H)-OH+Cl大减少了生成的抗体攻击天冬酰胺酶的可能性,延长了这种Cl0-(CH2CH20)-CH,药物的循环半衰期°]。另外，它可以使得小分子底物天冬酰胺自由通过,进人酶的活性位点进行催化反应。0-(CH2CH2O) - CH320世纪70年代，Davis首先对蛋白质的PEG化学修饰进Protoin-NH-行了较系统的研究(6。后来相继有一些关于用PEG的衍生物O-(CH2CH2O)n- CH,Pritein-NH2对天冬酰胺酶进行化学修饰的报导,所使用的方法和PEG的團1天冬酰胺酶 PEC2修饰的示意图衔生物不同,但它们所获得的结果都不很理想,修饰后的残余Fig.1 The schematic digum of asparnginse modifed by PEC2.活力较低,一般在 10%左右”。由于酶在结合底物时的构象1.1.2 试剂比较稳定,因此,本研究在对天冬酰胺酶进行修饰前先用其底中国煤化工i B,组成如下:二酸,0.25mg/mL NADH,1UCOT.YHCNM H G Ha缓冲液(pH8.收稿日期:004-09- 16;修回日期:2005 -01 -09作者简介:郭桥(1966- ),男，硕士,医学生物学高级工程师,从事细胞45)。因子的研究工作,E- mil: giao1966@ sohu. com; *通讯联系人:吴永溶液B:含1.25mg/mL L-天冬酰胺的50mmoI/L Tris- HCl革(1965-),博士,剛教授,从事分子生物学和研究，E - mail; yongewu缓冲液(pH8.45)。@ sohu. cm, Tel:0431 - 5531798,发表论文10余篇、著作2部。1.1.3 仪器2005年4月聚乙二醇修饰重组人天冬酰胺酶的研究33UV- 2501PC紫外分光光度计为日本岛津公司产品;荧光or分光光度计为日本岛津公司产品;超滤器为美国AMICON公8ml66m!司产品;冻干机为德国CHRIST公司产品。1.2 方法1.2.1修饰剂的合成与活化天冬酰胺酶的PEG修饰的原理见图1,PEG首先需用氰尿酰氯进行活化,经过活化的PEG可以与天冬酰胺酶中游离的- NH2反应,通过共价键结合到酶上,其中，如果在氚脲酰氯上结合一个PEC分子,称之为PEC1,结合二个PEC分子,称之为V(m)PEC2。具体方法如下:團3非修饰天冬酰胺酶的层析圄谱将下列物质装人500ml圆底烧瓶:20g单甲氧基聚乙二醇，.Fig.3 The gel fltration chromatogmuphy of unnxdied sparaginase100ml无水苯(除水处理) ,5g分子筛3A(加热烘干), 10g无水D碳酸钠(加热烘干) ,365mg氰尿酰氯。80°回流44h。将反应63ml70ml液慢馒倾出,离心。向上清液中加人200ml无水石油醚,沉淀，抽滤,将沉淀分离出。用800ml无水石油醚分6次洗涤沉淀。在37C的条件下干燥过夜,称重。1.2.2天冬酰胺酶的化学修饰将下列物质装入 100ml小烧杯: 10ng天冬酰胺酶, 2ml硼酸缓冲液,88pI(0.4mol/L)天冬酰胺。37C摇床振荡30min。向上述反应混合物中加入990mg活化载体(PEG:NH2 = 15:1)。V(ml)37C摇床振荡1ho加人80ml预冷的0.1mol/L(pHl0)磷酸缓冲圈4修饰天冬酰胺酶的层析图谱液。超滤,将超滤截留液冻干,称重。Fig.4 The gel flration chonatogoaply of modified apraginge1.2.3修饰后的天冬酰胺酶的层 析分析和分离将50mng修饰后的天冬酰胺酶溶于1ml 15mmol/L(pH7.0)activated PEG 1、的磷酸盐缓冲液中,上样于Sephacryl S- 200 high resolution柱,(ms50000流速为10m/h。将修饰酶层析后收集产物冻干,将冻干后的产物溶于少量的蒸馏水中,用PD-10除盐柱对溶解液进行除盐,真空冻干。1.2.4修饰天冬酰胺酶的生化性质研究St1.2.4.1修饰酶的蛋白质浓度测定采用BCA法,具体方法见文献[8]。1.2.4.2修饰酶的修饰度测定荧光胺可以与- -级胺 反应生成荧光化合物,而荧光化合20hM物所产生的荧光与一级胺的含量成正比,这种荧光的产生可以稳定几个小时,而过量的荧光胺在1 min内就会被水解掉而activated PEG 2、I不影响荧光的测定。因此,通过测定体系中的荧光强度就可(mw.10.000)以测得该酶中-级胺的数量,因此,就可计算出被PEG结合的- -级胺的数量,从而计算修饰度。60h取4支5ml印管,依次分别加人0pg/ml、1p/ml.2rg/ml、4yg/ml 的天冬酰胺酶(或修饰酶)溶液1. 5ml,并依次加入0.2035ml荧光胺试剂。室温下放置10min后,分别测荧光强度(激Retention time(min)发波长为390nm,发射波长为475nm)。图5 PEC的活化程度与时间的关系比较1.2.4.3修饰酶的酶活性测定图中曲线为PEG在活化不同时间后的凝胶过滤HPLC图谱天冬酰胺可以被天冬酰胺酶水解为天冬氨酸和氨,水解Fig.5 Relation betwen ativied degree and time of PEG后的产物天冬氨酸在谷氨酸草酰乙酰氨基转移酶(GOT)的作The curves are chronatography of gel flration HPLC of which PEC is activitied用下与a-酮戊二酸反应生成草酰乙酰胺和谷氨酸，而生成的草酰乙酰胺在苹果酸脱氢酶(MDH)的作用下与NADH反应生将800pl的溶液A和200pJ的溶液B加到石英比色杯中，成苹果酸和NAD* (见图2),NADH在340nm处有特征的光吸放人UV- 2501PC紫外分光光度计中, 37C保温1min,加入天收,随着反应的进行,吸光度随着会减少,吸光度减少的速率冬酰胺酶液,测反应速率。则体现了天冬酰胺酶的活性。1.2.4.4抗水解能力测定将一定量的非修饰酶和修饰酶溶于50mmoVLTris-HCl(pH8.8)(含1mmol/LCaCl, ).然后加入5mg胰酶,37C保温5、L-AaparagineA-apaegDL-Aepargne . NH,12.24h,中国煤化工进行柱层析分析。L-Aaparagine + a-Ketoglutarate-Oxaloacetate + L-Glutamate1.2.4.5MDH尾利CNMHGOxaloacetate + NADH -0at340m Mlate + NAD*三种注射液: (1)非修饰酶(2m/mL);(2)修饰酶(20mg/mL);(3)生理盐水。每组2只，10J/只,每周注射一次。尾静團2测定天冬酰胺酶活性的反应式脉取血,离心,取血清,冻存。然后用EISA法检测。Fig.2 Reaction o measurenent of asparaginase activity34生物技术第15卷第2期2结果与讨论75%。2.1天冬酰胺酶的修饰经过活化的PEC可以与天冬酰胺酶中游离的- NH反应,通过共价键结合到酶上。修饰后,天冬酰胺酶的免疫原性应该随被修饰程度的升高而减小，在修饰时采取了修饰剂与酶中的一NH2的摩尔比为15:1的加量关系。修饰后,采用分子筛层析法对修饰情况进行初步鉴定。结果见图3和图4。由于层析柱的柱料属于分子筛材料,故先流出柱的是分V(m)子量大的物质,在上述的层析图谱中出现了两个峰，而层析的圉6修饰天冬酰胺酶经胰酶水解后层析曲线样品是纯的天冬酰胺酶，所以推测前面的峰所代表的物质可曲线 I为消化24h;曲线2为消化12h:曲线3为消化Sh能为天冬酰胺酶分子的聚集体，而后面的峰则可能为天门冬Fig.6 The el flmion droanlopt d madd spengee dgrsedby .酰酶的单体。tpein. The curve 1:digsted for 24h;The cure 2:digsted for 12h;The caurve在修饰酶的层析记录图中,出现了两个峰,对于出现的两3:digeted for Sh.个峰有几种解释:(1)在非修饰酶层析图谱中就有两个峰,在2.3.3修饰酶的酶活性测定修饰的过程中两个峰对应的物质分别被活化的PEG修饰了，酶活力定义:1U为在最适反应条件下,每分钟转化1ymol但其修饰的程度不同,导致了修饰后产物的分子量出现了差天冬酰胺所需的酶量。异,从而在修饰酶的层析图谱中出现了两个峰重叠现象;(2)结果,修饰后天冬酰胺酶的活力降 为修饰前的23%。修饰时所用的活化载体是用单加氧基聚乙二醇和氰脲酰氯经2.3.4 抗水解能力结果与分析过回流制海的，单加氧基聚乙二醇和氰尿酰氯的化合程度与采用胰蛋白酶 消化修饰或非修饰的天冬酰胺酶作为其抗反应时的pH值、两种物质的量的比例及反应时间等因素有酶水解能力的指标,然后,用分子筛层析法鉴定胰蛋白酶消化关,在实验中给定的物质的量的关系下,化合的程度主要与反的程度。 结果见图6。非修饰的天冬酰胺酶的胰酶水解液在层析图中没有峰，从上图可以发现随反应时间的延长氰睬酰氯与单加氧基可见完全或大部分被水解,而修饰酶的峰几乎没有变化,表明聚乙二醇的化合程度是增长的,所以在修饰酶层析图谱上出在被 PECr修饰后天冬酰胺酶的抗水解能力显著增强,同时也现的两个峰可能是由于活化载体为混合物造成的,另外，如果从另 -一个方面显示出修饰的成功。活化载体是PBG和PEC2的混合物，由于PECG和PEG,与非表2修饰和非修饰天冬酰酶的活力测定修饰的天冬酰胺酶的结合力的不同也可以造成非修饰酶的修Table2 Activity d modifed anummodsparngnse饰度的不同从而导致两个峰的出现。非修饰酶活力比活力 修饰酶活力 表观比活力 实际比活力2.2修饰剂的选择与合成(U/m)(U/mg)(U/ng)(Umg)由于天冬酰胺酶在动物体内所体现的免疫原性与它的分93932.6子构象和分子中其它酶活性,如谷氨酰胺酶活性有关，所以可注:表观比活为以修饰酶的质 量作为蛋白质的质量计算的比活以用某些试剂对其进行修饰从而改变其构象或屏蔽其内部的力 :实际比活力为以测得的修饰酶中的蛋白含量计算的比活力。某些活性位点以消除或降低其免疫原性,许多化学修饰剂，如:2.4 修饰后天冬酰胺酶免疫原性的测定氨基酸聚合物、多糖类物质,脂类物质已被用于酶的修饰，但是分别以非修饰酶和修饰酶免疫鼠,免疫4次以上(每周1只有为数不多的试剂被证明为适合的,酶经-些化学修饰剂修次)之后,取静脉血(抗血清),通过EILISA法测定血清中产生饰后,虽然其免疫原性降低,但同时其活性也大大降低。抗体的相对浓度,结果修饰酶的血清抗体浓度明显低于非修为了获得低免疫原性而又保留很高酶活性的天冬酰胺饰酶,约为非修饰酶的20- -30% ,表明修饰酶的免疫原性明显酶,本实验采用了氰脲酰氯活化的PEG作为修饰剂，被修饰的降低。另外,在免疫鼠的过程中,发现修饰酶组的死亡率明显天冬酰胶酶中的某些基团带有两条聚乙二醇链(EG2),用它低于非修饰酶组,这很可能是由于免疫 原性的降低所至。作为修饰剂比只有一-条聚乙二醇链的PEG,更有效率。3结论2.3修饰酶的性质研究本研究用PEC对天冬酰胺酶进行了化学修饰，其目的是2.3.1修饰酶的蛋白质浓度测定在尽可能保持其活性的前提下降低其免疫原性，以更适于临由于天冬酰胶酶经化学修饰后,一些测定蛋白含量的方床的应用。法受到干扰,所以不能使用。本研究使用BCA法测定非修饰本研究采取了先用天冬酰胺酶的底物天冬酰胺进行保酶和修饰酶的蛋白浓度，发现其线性关系比较好适用于修饰护,同时使用大剂量的修饰剂，使其免疫原性降为原来的20-酶蛋白依度的测定结果测得的修饰天冬酰胺酶的蛋白含量30% ,并大大提高了其抗胰酶水解的能力，从而使其半衰期更约为29%(W/W)。长。经修饰后相同浓度下修饰酶的活性降为原来的23%。虽2.3.2修饰酶的修饰 程度测定然活性有一定程度的降低，但其更长的半衰期可以弥补这种修饰度(%) =(-1ng/ntom)x 10%0降低。有文献报导.修饰酶活性是与免疫原性成-定的相关Intu. = Intgm /修饰酶的蛋白质含量性,即免疫原性降得越低,其活性也越低。因为，在用修饰剂Imga为修饰酶的荧光强度，Ine为非修饰酶的荧光强度封闭抗原表位的同时,必然影响酶的活性部位的构象及与底(注:Intg ,Intem为同浓度下测定的荧光强度)。物的中国煤化工表l PEC修饰天冬酰胺酶的修饰度测定底物YHCNMH(C酶进行前，选将该酶用其Table ! Miciein degrce d umangnge modied by PEGC的结果。具有可以进行:ln中国修饰酶的蛋白质含量(WV) 国修饰度(先)临床应用的价值。4459829%15参考文献:由表1可知,采用该方法修饰的天冬酰胺酶的修饰度为[1]Ana I Fenande,Creory Gregriadis. Poyilylaledl apapginepepeetiomn, ativity end pamamckinetie[J]. Biochimica t Bioplbysica Acta, 1997,7第15卷第2期:35生物技术Vol. 15,No.2:352005年4月BIOTECHNOLOCYApr.2005131(1):26-34.[6]Sares Alexndre Leuth, Guimanaes Clodson Manso, Polakiewicz Brorislaw,[2 ]Bushman Jannifer , Palmieni Diane, Whima Herbert C, et al . Insight into thee al. ffects of palyethylene gdycol atachment on physicochemical and biologi-mechanism of aparginase - induced dqleion of anihonbin四in treatmentcal sability of E. coli L- aspanginse[J]. Intermational Jourmal of Pharma-of childhood acute lymphoblastice leukemia[J]. Leukemia Research, 2000, 24cutis,2003,237(1-2):163 - 170.(7)559 -565.[7]Davis F F. The onign of pegnogy[J].Advanced Drug Delivery Reriews,[3]Ayako Matsushima, Yoh Koden, Misao Hiroto, at al . Boajugtes of pro-2002,54:457 - 464.tein and polyethylene eyol: potent tols in biotechnologjcal processes[J].[8]Kolowski A, Haris J M.Some recent developments in the chemical modif-Jourmal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1996,2:1- 17.cation of proteins with a note on pplications to bipanacuticial[J,.Journa[4]姜忠义,高蓉,王艳强.蛋白质和多肽药物聚乙二醇化的问题与对of Contolled Release, 2001 ,72:217- 225.策[J].药学学报,002,37(5):396 - 399. .[9]Browm R,avis K, and. Hyland K. Propeiue measurement using bicinchoninie[5]Ane LFEemende,Cregary Gregriadis. The dfet d plylsiylation on the iw acid: eination of iterfering subtances[J]. Anal . Bichem, 1989, 189<(1):nogrmicity and nigricit d eparnginese: iplicatioin in is pemerananico[J]..136- 139.Intermational Jourmal of Parmeutics,2001,217(1 -2):215 - 24.树状多节孢诱变株与出发株间同工酶差异初探解玉红' ,张鹏3 ,付博',于森3 ,张海英3 ,周东坡*(1.天津理工大学环境科学与安全工程学院,天津3001912;2. 徐州师范大学生物系微生物教研室,江苏徐州21116;3.齐齐哈尔大学生命工程学院,黑龙江齐齐哈尔160161 ;4.黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080)摘要:为了探索紫杉醇产生菌发酵产生紫杉醇的机理，对紫杉醇产生菌树状多节孢HQD33和经LiCl、紫外线诱变产生的紫杉醇产量正突变的HQD33诱变菌株(P50- 2、PI - 6、P5 - 8、130- 2、150- 4)的同工酶和蛋白质(如:过氧化物酶同工酶脂酶同工酶、淀粉酶同工酶、过氧化氢酶同工酶以及可溶性蛋白和游离组蛋白)的电泳图谱进行了分析,结果显示:除过氧化氢酶同工酶以外其它酶和蛋白质的电泳图谱都有不同程度的改变。可初步推断，诱变使紫杉醇产生菌的分子生物学背景发生了变化，由于遗传背景的改变导致了产生菌细胞内部蛋白质和同工酶的变化，可进一一步认为紫杉醇的产生与试验所选的同工酶和蛋白质有一定的相关性。关键词:树状多节孢;诱变菌株;紫杉醇;同工酶;差异分析中图分类号:0814;Q55文献标识码:A文章编号1000311(2005)020 -0035-03The Preliminary Research on the Difference of Isozyme betweenNoclulisporium sylviforme and Its MutantXIE Yu- hong' ,ZHANG Peng2 ,FU Bo3' ,YU Miao' ,ZHANG Hai - ying ,ZHOU Dong- po'(1.College of Enviromental Science and Safety Fngineering, Tianjin University of Science & Technology ,Tanjin 300191;2. Depertment of Biology ,Xuzhou ormal University, Xuzhou 21116;3.College of Biongineering,Qiqihar University, Qiqihar 100161 ;4. Clle of Life Science, Heilongigng University, Harbin 150080, P. R. China)Abstract:To research the mechanism of taxol production in Noclulisporium syhiforme which productes taxol. This article studied four kinds ofisoymes and two kinds of protains abstracted from Noculisporiun sylniforme (HQD33) and its mutant strains(P50 - 2,P1-6,P5-8,L30-2,L50- 4) which is mutated from HQD33 , and analyzed the diference of the isozymes and proteins . The conclusion is the diference among theisozymesis very evident. It deduces that the mutation variatesthe genetic background of the strains that produces taxol , and that the variation of ge-netic background inducesthe variation of the isoxymes and proteins in strains. It can say that the producing of taxol relevances to the isozymes andproteins selected by us in this study.Key words: Noclulisporium syliforme ; mutant taxol; isozyme research; on the diference紫杉醇是二萜生物碱，具有广谱抗癌活性,对乳腺癌和卵1.1 材料巢癌等多种癌症都有特殊疗效",是一- 种很有发展前景的抗1.1.1试验材料癌药物。1993 年作者课题组分离得到了产紫杉醇的菌株菌株HQD33:分离自黑龙江省穆棱县的东北红豆杉(T.HQD33,经鉴定为树状多节孢[21 ,是一种新纪录菌属。同时在cuspidate) ,培养物保存在齐齐哈尔大学生命科学与工程学院该菌的基础上通过原生质体诱变和融合[10)选育出了几株高产微生物实验室(PDA斜面保存,4C)。菌株菌株P50- 2、P1- 6、P5 - 8:树状多节孢( Noduisporiun syuo-近年来,很多研究者致力于微生物发酵紫杉醇的研究,但ifomma)HQD33 经紫外线诱变后得到的诱变株。结果寥寥。究其原因是关于紫杉醇微生物发酵的产生机理没菌株L30-2、L50- 4:树状多节孢(Noulisorium sytiforma)有得到充分的研究和探讨。本文对紫杉醇产生菌HQD33和经HQD33经紫外线和氯化锂复合诱变后得到的诱变株。诱变筛选的诱变高产菌株的同工酶和胞内蛋白质进行了比较1.1.2 试剂分析,应用常规的研究技术对出发菌株和诱变高产菌株进行0.5%的溴酚兰,0. lmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0) ,0. 15molV生物分子水平和生化水平变化差异的比较研究,从而间接推L醋酸缓冲液。断高产诱变菌株提高产量的机理,本试验是对研究微生物发1.1.3培养基酵产生紫杉醇机理的一个尝试,到目前为止,还没有见到与本PDA液体培养基、PDA固体培养基、s7液体发酵培养试验研究目的和意义相关的文献报道,此类初步研究也将为基0)1 :配制方法见参考文献[3]。今后快速选育更高产的菌株的探索奠定理论基础。1.1.4仪器1材料与方法中国煤化工北京六- -仪器厂);电泳仪(三H市六一仪器厂); Beck-收稿日期:2004- 09- 15;修回日期:2005-01-12man超CNMHGg);H计。基金项目:黑龙江省自然科学基金资助项目(93-C- 11);黑龙江省.2方法“九五”重大攻关项目(C98C20- 16- 1)1.2.1菌体的培养 :作者简介:解玉红(1976- ),女,硕士,教授,从事微生物分子生物学和紫杉醇产生菌HQD33及其高产菌株P50-2、P1-6、P5 -环境生物技术研究，发表论文数篇;周东坡(1941-),男,教授，博士生8.I30- 2、I50-4在PDA固体斜面培养基上活化3d,后转接到导师,国务院特贴专家,从事微生物育种等研究,发表论文80余篇。