燃料乙醇工程菌的代谢工程进展

LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol 23 No 4 Jul, 2012621103969/isn.1009-0002.2012.04037综述燃料乙醇工程菌的代谢工程进展程倩,吴毅歆,何月秋,毛自朝云南农业大学农学与生物技术学院,云南昆明650201[摘要]能源问题是现今经济发展面临的主要问题之一,伴随着21世纪生物发展的步伐,基于微生物合成生物学蛋白组学和代谢组学的研究进展,利用组合基因的无标记基因删除与重组DNA等技术,构建以廉价的可再生生物原料为碳源、高效合成生物乙醇的发酵工程菌已成为研究热点。我们筒要总结了以大肠杄菌、啤酒酵母和运动发酵单胞菌为宿主的乙醇代谢工程改造的相关进展[关键词]代谢工程;合成生物学;燃料乙[中围分类号]Q789:TQ92[文献标识码]A[文章编号]1009-0002(2012)04-0621-06The Development of Ethanologenic BacteriumCHENG Qian, WU Yi-Xin, HE Yue-Qiu, MAO Zi-Chao*Faculty of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, ChinaCorrespondingauthorE-mail:maozich2000@sina.com[Abstract] It has been one of the main bottlenecks for energy issue in the economic development nowadaysWith the rapid progress of microbial synthetic biology, proteomics and metabonomics in the 21st century, it hasbeen becoa research hotspot to construct fermentative engineering bacteria utilizing less expensive, reproduc-ible bio-material as carbon source to biosynthesize ethanol high efficiently, which has been engineered with the introduction of marker gene-free deletion and DNA recombination technology. In this paper, the latest dynamics andachievement in the alcohol metabolism engineering of Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and zymomonas mobilis were summarized briefly.I Key words] metabolic engineering: synthetic biology; bioethanol全球经济的快速增长和工业化进程加速了对能代石油则为燃料乙醇。在汽油中加入一定比例的燃源的需求。能源供给不足已成为当今全球经济发展料乙醇,不但节省石油在使用过程中还能降低汽车的主要制约条件之一。目前,依靠石油等不可再生尾气中CO的排放量。目前绝大部分燃料乙醇的生能源远远不能满足需求,而且这些传统能源所带来产仍然采用以淀粉类和糖类作物为原料的传统发酵的环境问题的负面影响加重了生态压力。目前全球工艺,这种生产方式成本高,难以与传统能源竞争,石油储量仅可供开采40年,能源的短缺将大大限制在一定程度上限制了燃料乙醇产业的进一步发展。人类社会的发展。据统计,现在地球每年可以生成由纤维素、半纤维素和木质素组成的木质纤维的生物质总量达1440-1800亿吨(干重),相当于素广泛存在于碳薪植物和农作物副产品的秸秆和废1990~1995年全世界总能耗的3~8倍,是极为丰富的料中,因其具有高产量和可持续性的优点而成为更生物质资源,将其能源化是解决能源供给不足的主合适的生物质原料。但木质纤维糖化的难度大,且要途径。因此,利用合成生物学”代谢工程木质纤维中的半纤维素水解后形成难发酵的五碳糖和系统生物学P同等方面的原理与方法,研发生物能(主要是木糖和阿拉伯糖),木质素可裂解为对乙醇源以解决能源危机备受青睐。随着技术的进步,发酵微生物有抑制和毒害作用的酚类,因此加大了开发生物质能已逐渐成为仅次于煤炭、石油和天然乙醇的生产成本。气的世界第四能源,而生物质乙醇又是主要的石油目前天然的高效乙醇发酵菌株不能利用五碳燃料替代物。糖,而能利用五碳糖的菌株如大肠杆菌和芽孢杆菌无水乙醇是指含水量低于08%的乙醇用于替的乙醉产率却极中国煤化工,改造菌株,让其最大化地CNMHG混合物高收稿期:2011-11-22效发酵乙醇,并具有对酚类等毒性物质的耐受性,是作者简介:程倩(1987-),女,硕土研究生通伯作者:毛自朝,(E-mlil) maozich2000 Ina. com目前菌株改良的主流,并已取得了突破性进展622生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY VOL 23 No 4 Jul, 20121微生物的乙醇代谢途径速度快和副产物少,对糖的发酵速度及利用率均髙于酵母的优势,但与酵母一样,也不能代谢五碳目前已发现近百种天然发酵乙醇的微生物(包糖。自然界中,已发现的大部分微生物都能代谢戊括细菌、丝状真菌和酵母菌),但高效且可工业化的糖但却不能高效将糖转化成乙醇如大肠杆菌、产酸生产菌株较少。在工程化或天然的乙醇发酵菌株克雷伯菌( Klebsiella oxytoca)和树干毕赤酵母(Pich-中,葡萄糖作为优选的单糖,通过糖酵解(EMP)、磷 ua stupas)等。为获得高效利用五碳糖发酵乙醇的酸戊糖(PPP)和 Enter- Doudoroff(ED)等代谢途径形工业菌株,目前从两个方向进行代谢工程和合成生成丙酮酸。丙酮酸进一步通过基团转移、裂解和氧物学的改造,一方面是克隆酿酒酵母( Saccharomy化等代谢途径转化为乙醇(图1)。多数乙醇生产菌 ces cerevisiae)或运动发酵单胞菌中能将丙酮酸高效在进化过程中逐步形成在各种条件下均能最大化利转化成乙醇的酶基因,并在能高效代谢戊糖的微生用葡萄糖的特性,人们利用这一特点,通过代谢工程物中表达;另一方面,则是将戊糖代谢途径在传统改造或酶促转化,将其他单糖(如五碳糖)或非糖底的酿酒酵母和运动发酵单胞菌中表达四。在优良物转化到葡萄糖发酵产乙醇的主流代谢途径。菌株的改造中,除上述需要完整的代谢通路构建外,维持原料(底物)到乙醇代谢转化过程中,还原力(主2乙醇发酵途径的工程改造策略要是还原性辅酶I和Ⅱ的平衡)及有效能量(ATP)的产生消耗平衡也是工程改造成功与否的关键。在厌氧条件下,酵母菌可将六碳糖转化成乙醇和二氧化碳,是酿酒工业中用来发酵产乙醇的主要3工程乙醇发酵大肠杆菌的构建微生物,但缺点是不能代谢五碳糖。在自然界中,运动发酵单胞菌( Zymomonas mobilis)是目前发现的惟大肠杆菌有完整的己糖和戊糖代谢途径,但用的以D-葡萄糖、D-果糖和蔗糖为底物,并能将乙葡萄糖或木糖等进行发酵,产物中乙醇只占很小的醇脱氢酶及丙酮酸脱羧酶与ED途径相偶联而高效一部分,大部分为乳酸、甲酸、琥珀酸和醋酸等叫。产生乙醇的革兰阳性菌。与传统的生产乙醇的酵大肠杆菌中乙醇代谢途径以糖酵解的中间代谢产物母相比,运动发酵单胞菌表现出多方面的优越性,具丙酮酸为基础,在丙酮酸甲酸裂解酶复合物的作用有乙醇产率高、乙醇耐受力强、渗透压耐力高、发酵下,丙酮酸被分解成乙酰-CoA和甲酸。乙醛和乙醇ED葡萄糖甘露糖ZM4中阿拉伯糖半乳糖5磷酸木配糖6磷酸果糖5磷酸核糖酮酸糖酵解磷酸戊糖途径I基团转移Ⅱ裂解Ⅲ氧化乙酰辅酶A酮酸脱羧酶丙酮酸合成酶辅随A丙酮酸甲酸裂解醇2.3.1.54127.1乙酰辅酶乙醛乙酰辅酶甲酸HNADH乙醛脱氢酶MADH、乙醇脱氢酶NADH乙醛脱氢酶NAD-1.1.1.1121.10乙醛NAD乙醛乙醇脱氢酶NADH乙醇脱氢酶乙醇NADH11.1.1ML中国煤化工NAD乙醇CNMHG图1微生物乙醇代谢途径主要以己糖和戊糖为碳源形成主要中间产物内酮酸,再进一步代谢成乙醇左侧是以己糖和戊糖为碳源,在大肠杆菌中反应,右侧在运动发酵单胞菌中反应程倩等:燃料乙醇工程菌的代谢工程进展623脱氢酶将乙酰CoA还原成乙醇,消耗2个分子还原条件下有活性,而有活性的丙酮酸脱氢酶与乙醇脱性辅酶Ⅰ。整个代谢乙醇过程中,从糖酵解中产生氢酶结合后会使该菌在厌氧条件下发酵产乙醇,在1分子丙酮酸只有1个当量的还原性辅酶I生成。phh的作用下,丙酮酸形成乙酰CoA,产生另一个当而从1分子丙酮酸到1分子乙醇的过程需要消耗2量的NADH用于乙醇发酵,从而保持了细胞内的氧个当量的还原性辅酶Ⅰ,氧化还原不平衡,因此需要化还原平衡。更多醋酸的产生来维持细胞内的氧化还原水平。Kol1除了以葡萄糖和木糖为底物外,还可以利运动发酵单胞菌中乙醇代谢的2个关键酶是丙用木质纤维素类的其他糖组分,如甘露糖阿拉伯糖酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶,分别将丙酮酸转变为乙和半乳糖等,在半纤维素水解液中的混合糖培养基醛和将乙醛转化为乙醇叫。该过程中,丙酮酸到乙中糖的利用按葡萄糖阿拉伯糖和木糖的顺序分别醇的过程总共只需要1个还原性辅酶I,与糖酵解获得了最大理论得率的乙醇。但其不能利用纤维2产丙酮酸生成的1个还原性辅酶I刚好达到氧化还糖,产酸克雷伯菌含有天然的ps基因,可有效利用原反应的平衡。大肠杆菌的乙醇发酵改造中目前已纤维2糖,因此,将编码该糖的Ⅱ型酶和磷酸-β-葡有多种尝试,克隆运动发酵单胞菌中的pde(丙酮酸糖背酶的cas操纵子引人Kol1,使其能直接发酵纤脱羧酶基因)和adhB(乙醇脱氢酶基因)融合构建的维素生产乙醇。pet( Production of ethanol)操纵子,在大肠杆菌中表达,获得了较高的乙醇产量,占发酵产物的95%四,4酵母戊糖代谢工程的改造进一步提高乙醇产量,将p启动子与pet操纵子融合在一起整合到宿主基因组中,结果发现重组后的假丝酵母( Candida)、管囊酵母( Pachysolen)和大肠杆菌的乙醇产量下降,可能是由于pdc的低水平毕赤氏酵母( Pichia)是目前发现的能直接利用木糖表达,通过基因敲除的手段将编码延胡索酸还原酶进行发酵的酵母属,在酵母的戊糖代谢方面也取得的基因( frdABCD)删除,得到菌株KOll,从而打断了很大进展。将树木毕赤酵母中能代谢木糖的相关基延胡索酸到琥珀酸的代谢通路琥珀酸的量下降了因xyll和xy2(编码木糖还原酶XR和木酮糖脱95%,在葡萄糖或木糖的富营养培养基里,乙醇的产氢酶XDH)转入酿酒酵母中表达,尝试改造其木糖量基本达到理论值100%-。对比亲本,KO11的最代谢能力咧。该策略中木糖在木糖还原酶作用下转大生长速率增加了30%,糖分解速率也增加了化为木糖醇需要消耗 NADPH,而木糖醇在木糖醇脱50%。通过DNA芯片检测,发现这种改变是由于木氢酶的作用下转化为木酮糖的过程伴随NADH的产糖代谢基因的高表达。高浓度的碳源发酵才能获生,厌氧条件下 NADPH和NADH不能维持平衡,重得高浓度的乙醇,而它们均能抑制工程菌株的生长组菌不能正常生长,合成大量木糖醇和较少的乙醇与代谢,采用富营养法用肉汤培养基来优化KO11,研究者尝试将发酵液中通入氧气,将过量的还原当筛选高浓度的碳源和乙醇高耐受的菌株,获得量(NADH)排出,但发酵过程需氧限制乙醇的产生;LY01,对比KO11,乙醇浓度从35gL增加到50g/通过控制 XR/XDH的比率列仍未取得好的结果L,以木糖为碳源,乙醇增加到60gL。DNA芯Roa等在上述工程菌中删除利用 NADPH为辅酶的片检测结果显示甘氨酸和甜菜碱的合成均增加,它谷氨酸脱氢酶GDH1,高表达以NADH为辅酶的们都对渗透压起保护作用,增加了LYo1的乙醇耐受GDH2,通过调氨同化途径调节NADP和NAD的平性。由于KOl1和LYOl均需要丰富的营养,乙醇衡,工程菌的乙醇产量增加了16%,木糖醇积累下降生产成本太高,需要进一步改进。通过重组工程,将了44%。进一步通过蛋白工程的方法,将木糖还由KOl发展而来的产乳酸菌株中编码NADH的基原酶突变为能优先应用NADH而非 NADPH,以提高因删除,并将含有运动发酵单胞菌乙醇途径的pde、木糖乙醇代谢的效率。同样,将细菌和真菌来源的adhA、adhB基因串联,随机插入KOll基因组中叫。阿拉伯糖代谢途径分别转入啤酒酵母,尝试对阿拉在添加了木糖的无机盐培养基上发酵,48h后发现伯糖的代谢能力。其中,将细菌阿拉伯糖代谢途径9%的木糖能获得4%的乙醇。以葡萄糖或木糖为碳所涉及的3个酶转入啤酒酵母,细胞整体的氧化还源,Kim等在大肠杆菌K-12中阻断内酮酸转化为乳原平衡;而导入真菌包括5个酶的基因,其表达细胞酸(△hA)、丙酮酸转化为乙酸(△aceF)和丙酮酸裂内的氧化还原不平衡。啤酒酵母中引入真菌的阿解成甲酸的途径(ApB),并辅以化学诱变,所获的拉伯糖代谢途径,刚阿拉伯糖为碰源7酸的产量很大肠杆菌突变体在无外源基因表达的前提下,得到低,而将梢物乳中国煤化工nm)中的82%的乙醇产率圓,在该菌所编码的内酮酸脱酶阿拉伯糖途径转CNMHG043g乙体系PDH中,其内部基因发生突变,导致其在厌氧醇/g阿拉伯糖的消耗,乙醇产率为029g(gh)生物技术通624LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol23 No 4 Jul, 20125运动发酵单胞菌的戊糖代谢工程改造率降低和大肠杆菌的生长速率减缓,因此须优化PTS突变菌株,挑选在葡萄糖培养基上迅速生长的运动发酵单胞菌以葡萄糖和果糖为底物时,能菌株~。通过提高葡萄糖转运蛋白(gaP编码的半够得到近似理论产量的乙醇;但碳源换成蔗糖时,由乳糖透性酶)或磷酸化系统(gl编码的葡萄糖激酶)于副产物果聚糖和山梨醇等的形成导致乙醇的生成的表达,增加了对葡萄糖的摄取利用咧。另一种解率较低。该菌具有高耐糖(400g/葡萄糖)、高耐乙除CCR的策略是用不依赖cAMP的CRP突变体醇(100g/L乙醇)川"4、低生物量高乙醇产率及发酵用CRP突变体取代野生型CRP后,少数基因对葡萄速度快等优点,主要缺点是不能代谢戊糖,且会产生糖表现出敏感性,但不能彻底消除CCR效应。另乳酸、乙醛、醋酸等代谢副产物发现,内酮醛是糖代谢消耗的抑制剂到,将丙酮醛克隆大肠杆菌中戊糖代谢途径关键酶木糖异构合成酶的基因敲除后能提高发酵中对混合糖的利酶(xyA)、木酮糖激酶(xy1B)、转酮醇酶(aB)和转用醛酶(tktA)基因并构建2个人工操纵子,在运动发酵62非糖类底物乙醇发酵菌的工程改造单胞菌中进行表达,结合适应性诱导培养,得到能以对非糖类的脂肪酸和甘油的乙醇发酵给予了很木糖为惟一碳源、乙醇产量高达88.2%的菌株門。在大关注。脂肪酸经β氧化途径后全部碳原子都合成运动发酵单胞菌ATCC39676中表达大肠杆菌中涉了乙酰-CoA,因此脂肪酸由于其高的储能和100%及代谢阿拉伯糖的L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激的碳利用成为未来潜在的生物燃料。而以葡萄糖或酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-异构酶、转醛酶及转酮醇木糖为碳源,通过糖酵解途径产生1分子的乙酶,以阿拉伯糖为惟一碳源,乙醇产量高达98%酰-CoA的同时也产生1分子的二氧化碳或甲酸,碳原子的去路因副产物的产生,损耗了乙醇代谢途径6其他乙醇发酵菌的工程改造碳源的利用空间。 Dellomonaco等对软脂酸和葡萄糖的发酵进行了对比,从每克软脂酸中能获得的最6.1高效运用混合糖发酵乙醇菌株的改造大理论乙醇产量可达138g,而从每克葡萄糖中只上述均是单独以戊糖或己糖为碳源进行的工程能得到051g乙醇,可见以脂肪酸为生物原料能获菌改造,而目前最有前景的木质纤维素乙醇的生产得更多的生物乙醇。甘油是一种多羟基化合物,在流程第一步是水解,水解产物为戊糖和已糖的混自然界主要以甘油酯的形式广泛存在于动植物体合。野生型大肠杆菌在混合糖的利用上有先后,优内。油性种子中各种三酰甘油的混合物酯化后能转先利用六碳糖,如葡萄糖、果糖等,之后才利用木糖、换成甘油,而对藻类的研究发现其能高效、持续产阿拉伯糖且效率较低,这种现象被称碳的分解代谢生大量的三酰甘油,如杜氏藻属( Dunaliella)在4阻遏(CCR),这种调节机制表现为第一碳源对第二mo/ L NaCl的条件下生长,可维持细胞内甘油累积碳源转运和利用过程中所需基因的表达阻遇。由高达78moL。甘油可以转换成糖酵解代谢的中于CCR的存在,对木质纤维素水解后的戊糖的利用间产物磷酸烯醇式丙酮酸或内酮酸盐,可以用甘油降低和不彻底,导致乙醇产量很低。来代替糖,大幅度降低成本。另外,甘油代谢可获得在大肠杆菌中,CCR涉及细胞内操纵子特殊调2倍于葡萄糖或木糖代谢的还原性辅酶。甘油代谢节机制,如诱发排斥和诱导物排除,与糖的利用调产物为乙醇和甲酸或乙醇和H2将编码延胡索酸节系统有关(SURS)。通用代谢途径调节主要信号还原酶的基因fd(打断琥珀酸通路)和磷酸转酰酶因子包括cAMP受体蛋白即转录激活体CRP、第二基因pa(打断醋酸的通路)敲除,得到的菌株的乙醇信使cAMP腺苷酸环化酶和葡萄糖磷酸烯醇丙酮酸产量能达到理论最大值;在此基础上,引进fF基因糖磷酸转移酶系统(PTS)中复合酶ⅡA(EⅡA)。(编码甲酸氢裂解酶FHL),得到的突变菌株的乙醇磷酸化的EⅡA首先结合并激活腺苷酸环化酶,合和甲酸产量高达理论最大值的92%96%,但生长速成cAMP,高浓度的cAMP与其受体蛋白形成率却有所下降。用葡萄糖发酵,产物为乙醇和二CAMP-CRP复合物,并激活相应单糖代谢基因的启氧化碳,由于气体的释放导致碳原子的损耗;而甘油动。在葡萄糖或其他PTS糖存在的情况下,EⅡA发酵能够获得2倍产量的燃料.并且减少废气的产处于非磷酸化状态,不能激活腺苷酸环化酶,进而不生。因此甘油的生物代谢越来越受重视。能转运代谢其他的糖类。为此,可在代谢工程基础YH中国煤化工上采取各种策略来减缓CR。一种方案是在多样糖7结论与展望CNMHG的混合培养基上筛选PS失活体,CCR的作用减轻增加了对混合糖的利用,但是会出现对葡萄糖利用随着微生物基因组学、蛋白组学和代谢组学的程倩等:燃料乙醇T程菌的代谢工程进展625发展,可以构建能以木质纤维为原料高效合成生物物种及基因资源优势进行乙醇发酵菌株的构建,并乙醇的发酵菌,这正以前所未有速度改变着生物乙通过基因组、蛋白质组、转录组和代谢组学的技术组醇的合成工业。从生化代谢途径上看,乙醇合成主合,分析、筛选并获得可高效利用廉价生物质进行乙要通过中间代谢物内酮酸和(或)乙酰辅酶A转化而醇发酵的工程改造菌株,为生物质乙醇产业服务。来。应用代谢工程、合成生物学等策略,高效增加上述重要中间化合物及其向乙醇转化的代谢通路,可参考文献以构建重组高效产乙醇菌株,目前已在大肠杆菌、酒酵母和运动发酵单胞菌等为宿主的乙醇代谢工程叫方诩、秦玉琪,李雪芝,等.纤维素酶与木质纤维素生物降解中获成功。在此基础上,未来的乙醉发酵菌代谢工p] US Congress. Energy Policy A+d20851205,109icmg程将从以下方面展开。58th采用相似策略,在其他革兰阳性菌[如枯草芽孢 e European Parliament, the Council of the European Union菌( Bacillus subtilis)、热纤梭菌( Clostridium thermoDirective 2003/30/EC of the European Parliament and of theCouncil of 8 May 2003 on the promotion of the use of bofucallum)、谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium glutamiels or othermenewable fuels for transport[Z], Official J E U,cum)]、革兰阴性菌[如多动拟杆菌( Bacteroides poly2003,L123/42.pragmatic)、菊欧文杆菌( Erwinia chrysanthemi).]peis.mheof synthetic biology[J]. Appl MicrobiolBiotechnol,2006734):735-739物克雷伯杆菌( Klebsiella planticola)]单细胞真菌lsk. ou H.,Hm,Ts.ta. Metabolic engineering of[如嗜鞣管囊酵母( Pachysolen tannophilus)、树干毕microorganisms for biofuels production: from bugs to syntheticbiology to fuels[J]. Curr Opin Biotechnol, 2008, 19(6): 556-563赤酵母、休哈塔假丝酵母( Candida shehatae)、酒香 [6]Bailey J E. Toward a science of metabolic engineering]. 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Selec程中的乙醇抗性,降低发酵糖类的抑制效应及乙醇tion and optimization of microbial hosts for biofuels productionJI Metab Eng2008.10:295-304分离过程的能耗。因此,通过乙醇发酵菌株进行高[3 Postma P w, Lengeler J W, Jacobson G R. Phoephoenolpyr温适应诱导和〔或)与近源髙温耐受菌株融合等策略vate: carbohydrate phosphotransferase systems. in Escherichia筛选外高温耐受菌,或直接将高温耐受非乙醇发酵coli and Salmonella typhimurium]. Microbiol Rev, 1993, 57(3)543-594菌[如马瑞氏热厌氧杆菌( Thermoanaerobacter math-4] Saier M H. Vectorial metabolism and the evolution of trans-ranⅱ)、解糖热厌氧杆菌( Tsaccharolytic)、热葡糖port systems[J). Bacteriol. 2000. 182: 5029-5035[15] Hermandez-Montalvo V. Valle F, Bolivar F et al. Characteriz-苷酶地芽孢杆菌( Geobacillus thermoglucosidasius)tion of sugar mixtures utilization by an Escherichia coli mu.热纤梭菌]进行乙醇代谢改造,将是高温乙醇发酵菌tant devoid of the phosphotransferase system[J]. Appl Microbi-研发的主流。ol Biotechnol. 2001.57: 186-191[16] Nichols NN, Dien B S, Bothast R J. 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