木质纤维生产燃料乙醇的生物转化技术

第43卷第5期林业科学VoL 43. No. 52007年5月SCIENTIA SILVAE SINICAEMay,2007木质纤维生产燃料乙醇的生物转化技术陈介南王义强何钢章怀云周再魁(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所长沙410004摘要:木质纤维生物转化乙醇可以避免以粮食为原料生产燃料乙醇所带来的“与农争地”和“与人争食”的弊端,兼得经济、生态、环保、社会多重效益。木质纤维原料的物理化学特性决定其具有不同于淀粉和糖类原料转化的难度和复杂性,这也是木质纤维生物转化乙醇成本居高难下、商业化裹足不前的主要技术原因。本文以国际(特别是美国)的研究和开发进展为背景,探讨木质纤维生物转化乙醇的几个富有挑战性的技术问题,并在同步糖化共发酵(SSCF)概念的基础上,提出优化的并行糖化共发酵生产模型。关键词:生物能源;燃料乙醇;木质纤维;生物转化;发酵工程中图分类号:TQ352文献标识码:A文章编号:1001-7488(2007)05-0099-07Bioconversion of lignocellulose to EthanolChen Jienan Wang Yiqiang He Gang Zhang Huaiyun Zhou Zaikui(Institute of Biological and Enironmental Science Technology, Central South University of Forestry and Technology Changsha 410004)Abstract: An overview of recent advances in biological lignocellulose to ethanol technology is presented. The emphasis ofdiscussion is especially on pretreatment, enzymatic/metabolic engineering, C/Cs cofermentation, lignin utilization, and processoptimization, which are of primary importance to the successful application and commercialization of lignoceellulose-basedbioethanol technology. A consolidated lignocellulose-to-ethanol process model is proposed as conceptual improvement to thesimultaneous saccharification and cofermentation( SSCF) model endorsed by U. S. DOE national renewable energy laboratoryNREL)and modified by various industrial applicaKey words: bioenergy ethanol lignocellulose; bioconversion; fermentation生物乙醇( bioethanol)是一种最易普及的生物燃料(相较于生物柴油和燃料电池),凭借其经济、环保、实用等多维优势而日益成为替代汽油等传统能源的新能源之星。迅速普及的汽油醇(10%乙醇、90%汽油)以酒精作为助燃/抗爆剂直接取代 MTBE( methyl tertiary butyl ether)。世界各主要汽车制造商都能生产以乙醇汽油(乙醇含量达85%)为燃料的汽车(如美国),甚至飞机也可以使用乙醇燃料(如巴西)。目前全世界超过90%的乙醇来自生物质,但多以粮食[如玉米( Zea mays)、小麦( Triticum aestivum)、高粱( Sorghum vulgare)]和糖类作物[如甘蔗( Saccharum officinarum)、甜菜( Beta vulgaris)]为原料( Badger,2002)木质纤维是地球上数量最大的一种可再生资源。据估算,如果发展能源林业与回收利用废弃木质纤维(可回收部分约占总量的1/3)并举,则每年可保障替代1/3以上运输燃料的酒精产量。为此,发展经济有效而环境友好的木质纤维生物转化乙醇技术,已成为世界生物能源科技发展的战略制高点。美国等国家已开始将生物能源研究和开发的战略重心转移到以木质纤维生产乙醇的方向。针对我国国情,发展以木质纤维生物转化乙醇为重点的生物能源技术,建立以能源林业为依托并综合利用大量农业废弃物(如秸秆、皮壳等)( Kim et al.,2004)、林业残余物(如锯木屑、刨花、木材和造纸工业废料等)、城乡垃圾和杂草等低成本木质纤维资源的原料保障模式,可以避免以粮食为原料所带来的“与农争地”和“与人争食”的弊端,兼得经济、生态、环保、社会多重效益,是全面协调可持续发展的必然要求。木质纤维( lignocellulose)主要由纤维素( cellulose(约占1/3-1/2)、半纤维素( hemicellulose)(约占14-1/3)和木质素( lignin)(约占1/5~1/4)组成。纤维素和半纤维素经过糖化和发酵转化为乙醇( ethanol),而木质素的降解物不含可发酵糖,只能通过燃烧供热(或发电)或化学转化为燃料添加剂(或其他生物制品或工业原料)加以综合利用(图1)。中国煤化工木质纤维原料的糖化液中所含的可发酵糖( fermentableCNMHG素的葡萄糖(D收稿日期:2006-08-08基金项目:国家948项目(2006-4-123)。林业科学卷glucose)、甘露糖(D- mannose)和半乳糖(D- galactose)等6碳(C5)H-C-糖,以及源于半纤维素的木糖H-C-OH HO-C-OH(D- xylose)和阿拉伯糖(L-H-C-OH H-C-OHHO-C-Harabinose)等5碳(C5)糖。普通CHrOH CH-OH葡萄糖甘露糖拉伯糖微生物(如酵母)只能发酵CArabin糖,对C3缺乏代谢能力,而且易H-C-OHH-C-OHC3发酵受降解产物的抑制木质纤维原料的理化特性CH,CH:OH决定了其具有不同于淀粉(如玉米、高粱)和糖类(如甘蔗、甜菜)燃烧供热供电原料转化的难度和复杂性,因此木质纤维生物转化是复杂且存Ch fermentation燃料添加剂生物乙醇在许多不确定因素的动态过程Bioethanol( Lin et al.,2006)。将木质纤维原料经济有效地转化成乙醇和图1木质纤维原料的构成及其利用其他生物产品,取决于许多因Fig. 1 Structure and use of lignocellulose material素。本文试图以国际(特别是美国)的研究和开发进展为背景,探讨木质纤维生物转化乙醇的几个富有挑战性的技术问题,特别是预处理、酶活性、C/C3糖共发酵、木质素的综合利用和工艺优化1经济有效的快速预处理技术木质纤维材料中的可糖化纤维素和半纤维素在木质素包裹下形成稳定的结构,很难被直接水解或酶解纤维素由糖分子的极性基团(- OH groups)通过氢键( hydrogen bonds)相连成长链,在木质素的包裹下形成坚固而稳定的晶体结构,在普通条件下不易被水解或稀酸(稀碱)糖化,酶解糖化是最为经济有效而环境友好的途径。半纤维素分子和纤维素类似,也是由糖分子构成长链,但其非晶体(随机、不规则)结构比较脆弱,不像纤维素那样强稳,很容易在稀酸(或稀碱)预处理中被糖化。木质素在植物体中起结构强化和支撑作用,也是植物抵御病菌侵袭的物理障碍,不容易被微生物降解,特别是在缺氧条件下。富氧条件下木质素的生物降解当缓慢(需要许多天),难以达到工业规模生产的要求。木质纤维原料通常需要适当的预处理( pretreatment)来破除木质纤维的晶体结构及木质素对纤维素和半纤维素的包裹,增加供酶接触的有效表面积( Grethelin,985),并消除对微生物有危害的毒性物质,以利生物降解( Gharpuray et al.,1983)预处理方法可以是物理的、化学的、生物的,也可以取其交合运用,常用的如表1所示。在选择预处理方法时,要考虑木质纤维原料的特点、经济和环保性能要求,以及整体工艺设计,避免盲目性。根据文献,最为看好的是蒸爆( steam explosion)酸解( acidic hydrolysis)和碱湿氧化( alkaline wet oxidation)2C/C5糖共发酵微生物代谢工程技术木质纤维含有半纤维素,其糖化不仅产生C糖( D-glucose及其异构体),而且有C3糖(D- xylose和Larabinose)。由于普通酵母(yeas)只能发酵C,对Cs缺乏代谢能力,而且易受降解产物的抑制,半纤维素的利用在相当长的时期被忽视,直接影响了木质纤维原料生物转化乙醇的经济效益。尚无天然微生物能够将木质纤维糖化液中的C6和C糖同时快速有效地转化为乙醇( Ingram et al.,1995),尽管一些微生物(如Neurospora crassa)能够将纤维素和半纤维素直接转化成乙醇c1 1004. DL-dtare et al., 1997).因此,开发出能对C和C3糖进行快速完全、同步发酵并且扩中国煤化工成为当务之急。通过遗传重组来解决C5C5糖共发酵难题已在一些微CNMHG见的 Saccharomycecerevisiae(Johansson et al., 2001), Zymomonas mobilis( Sprenger, 1993)Fu Escherichia coli( Burchardt et al., 199Dien et al.,2003; Zhou et al.,1999)。这些是研究和应用基础相对较好的,也是最成功的重组平台( zaldivar第5期陈介南等:木质纤维生产燃料乙醇的生物转化技术101表1常用木质纤维原料预处理方法Tab. 1 Lignocellulose pretreatment methe预处理方法描述特点参考文献Pretreatment methodReference碎机械研磨碾压,或打碎,效果与颗粒大小和分布有关工艺要求不高,但能耗大,效率低 Simple,蒸爆高温(200℃)高压蒸汽将小块化原料爆破数十秒至几分能耗高,要求特殊设备,有时糖化效果不elevated temperatures(200 C)and t High energy input, specicalized equipmentpressures for 30 seconds to a few minutesvariable saccharification efficiency酸/碱水解稀酸(1%H2SO4)或稀碱(2%-5%NaOH)和高温(100较为经济有效,适合各种木质纤维原料200℃)下进行,时间不- Dilute acid(1%H2SO4)or但影响后继反应环境 Efective, suitable for Grethelin(2%-5% NaOH)hydrolysis at elevated temperatures most lignocellulosic feedstocks, but affects(100-200C), with various reaction timessubsequent process environment碱湿氧化弱碱Na2CO3溶液加温加压加氧处理10min左右避免产生大量对发酵微生物有抑制作用 Linke et alAlkalineOxidation in weak alkaline solution at elevated temperatures的降解物 Avoid inhibitory products such2002: Schmidtoxidation (150-200 C)for 10-15 min, usually with added oxygen furfuraleral.,1998Ammonia/10%氨溶液浸泡24-48h,脱除大部分木质素10%可能损失部分半纤维素(特别是氨浓度较氨处理lapagliatreatment ammonia/urea treatment for 24-48 h, most lignin removed高时) Partial loss of hemicellulose, especiallyat high ammonia/ urea concentrations使用白院菌等降解本质素的做生物Uwm,数周)Sm:m)Hawada ef al. 1995eral,,2001)。重组S. cereuisiae发酵路径遇到的一个棘手问题是C(如L- arabinose)转运( transport)不好,使发酵达不到理想效果。目前美国能源部的国家可再生能源实验室(NREL)已经在攻克这一难题。美国佛罗里达大学的 Ingram教授领导的实验室于20世纪80年代就尝试了以外源基因补充(或改进)受体微生物的发酵代谢途径( Ingram et al.,1987)。他们将 Zymomonas mobilis的C发酵基因转入具备C发酵途径的 Escherichia coli,除了成功使大肠杆菌获得在富氧( aerobic)和缺氧( anaerobic条件下发酵 pyruvate的功能外,这个由 lactose启动子( promoter)加 pyruvate decarboxylase(pd)和 alcohol dehydrogenase(adh)基因串联组合的操作元( operon)还使 pyruvate的代谢具有向发酵 ethanol方向倾斜的选择性,并使微生物生长明显优于对照。这一操作元在 Clostridium cellulolyticum中也得到较好的表达( Guerdon et al.,2002; Jennet2000)。相对于酵母发酵(以小时计)来说,细菌( bacteria)发酵有速度快(以分钟计)的优势( Badger,2002)。NREL资助的研究( Zhang et al.,1998)成功地把C糖代谢所需的7个外源酶基因(包括 araBAD Operon, Lee et al.,1986)以3个操作元串联在一个质粒载体( vector)转入2 ymomonas mobilis并获得了80%~90%的CC共转化率。从遗传重组的 Zymomonas mobilis表型分析可以推导,这3个操作元( Pea xylA/xylB, P-araBAD和Pal/tkt)通过ED途径( entner- doudoroff pathway)( Conway,1992)与内源控制 pyruvate发酵的操作元(Pl-pdaadh)( Ingram et al.,1987)并联成完整的CC5发酵代谢体系(图2)。ED途径是 glucose→ pyruvate的3个已知代谢途径中(其他是 glycolysis和 pentose phosphate pathway)较简单而有效的一个。3提高酶活性的微生物酶工程技术木质纤维的生物降解是由一系列纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶组成的复杂系统来执行的。一般纤维素酶生产菌也生产半纤维素酶(及或多或少的木质素酶)(如 Phanerochaete chrysosporium)( Broda et al.,1994)。因木质素不含可发酵糖,其降解是个综合利用的问题,不是糖化的目标。在工业规模的木质纤维生物转化中,大部分半纤维素在预处理阶段就被糖化,而且许多中国煤化工性,故纤维素水是酶解糖化阶段的重点对象。纤维素酶按存在状态可分为自由合酶( complexed即 cellulosomes)系统。好氧真菌(最著名的是 Trichoderma reeseiCNMHGa5和 Thermobifida)般产生自由纤维素酶,而络合纤维素酶系统则主要源于厌氧细菌(如 Clostridium和 Ruminococcus)和少数厌氧真菌(如 Piromyces)林业科43卷木糖阿拉伯糖-arabinoseED途径Operon磷酸戊糖途径5-磷酸酸木酮糖操纵元OperonGlycolysis6确酸果糖NADH3-确酸甘油P图2木质纤维生物转化乙醇中C/C3共发酵的可能代谢途径Fig. 2 Probable pathway for C/Cs cofermentation of lignocellulose to ethanolrag: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter; ayLA xylose isomerase; rydB: xylulokinase: araA L-arabinose isomerase;al: transaldolase; tk: transketolase(Zhang et alpromoter: pdc: pyruvate decarboxylase; adh alcohol deh个纤维素酶系统按作用方式可大致分为:内切葡萄糖苷酶( endoglucanases)(EC3.2.1.4);外切葡萄糖苷酶( exoglucanases),包括 cellodextrinases(EC3.2.1.74)和 cellobiohydrolases(EC3.2.1.91)和(外切型)葡萄单糖酶( glucosiEC3.2.1.21)(图3)。纤维素酶成本的居高难下始终是葡萄糖苷酶(胞内物特酶)个困扰木质纤维生物转化乙醇技术产业萄糖苷酶化的主要障碍之一( McAloon et al内切葡萄糖苷酶纤维二糖水解Endoglucanase2000)。遗传重组技术不仅用于控制(或纤维素纤维二糖(1省萄糖Cellulose调节)发酵代谢途径( metabolic pathway)(Glucose )nlobiose( Ingram et al.,1998),而且也是纤维素酶内切葡萄糖苷酶+纤维二糖水解酶EndoglucCellobiohydrolase优化(增强活性)的一个重要技术手段内切葡萄糖苷酶(葡萄糖苷酶)xoglucosidase(B-glucosidase,1992)应用遗传重组技术开发优质纤维素图3纤维素酶降解系统酶、半纤维素酶和木质素酶工程菌,高活Fig. 3 Biodegradation of lignocell性纤维素酶酵母工程菌和产朊假丝酵母工程菌等GEM材料已取得显著成绩,包括将纤维素酶编码序列克隆到细菌、酵母、霉菌和植物中,以产生新的更优质纤维素酶( Lynd et al.,2002)。一个重要进展是细胞表面工程技术( Murai et al.,1998),即在酵母细胞表层蛋白(a-凝聚素等基因上植入纤维素酶等基因,使菌体和酵素在反应器内始终保持高浓度,持续反复利用,从而降低成本,提高糖化效率。归纳起来,微生物酶工程技术策略可分为:1)选用抗逆高产工程菌(如NREI/ GENENCOR采用嗜热耐酸性的 Acidothermus cellulolyticus),改进纤维素酶的就地生产(on- site production)( Thygesen et al.,2003);2)用异源纤维素酶(如源于 bacteria, fungi, and plants)重组更有效的纤维素酶系统(例如,在最常用的 Trichodermaree维素酶系统的基础上添加 Aspergillus的 B-glucosidases,从而克服 glucose的抑制)( Gunata et al.,199Yan et al.,1997);3)将外源纤维素酶基因转入优质发酵工mobi),使之至少能供应木质纤维直接转化乙醇所需的部中国煤化工2004: Zhou et al1999);4)将外源发酵基因转入纤维素酶生产菌(如 TrichodermCNMHGcum),实现酶解和发酵工程菌的一体化( Guedon et al.,2002);5)运用代谢工程策略增加欲求的( gene transfer)、强化有利的( gene overexpression)和排除(或弱化)不利的( gene suppression/ gene knockout)( Kamionka et al.,2005)代谢途径第5期陈介南等:木质纤维生产燃料乙醇的生物转化技术103( Lynd et al.,2002)。此外,应用纳米技术进行分子设计,可以“对号入座”制造与纤维素酶结构和功能类似的纳米催化剂,获得新的或更加稳定转化的催化途径,并实现催化剂的固定重复循环使用。同时,通过纳米传感器和无线网络对酶解/发酵过程进行智能化在线监控,可以实时精确地优化动态反应条件,提高酶解/发酵效率。4环境友好的综合利用技术木质素不含糖,目前还没有发现将其转化为乙醇的有效方法,其主要用途是燃烧发电或供热。开发高附加值的木质素综合利用技术,通过增加收益来降低(抵消一部分)木质纤维生物转化乙醇的生产成本,是使经济和环保相得益彰的必然选择。由木质素生产高 octane的燃料添加剂( Ragauskas et al.,2006; Shabtai etal.,1999技术已取得进展,将纤维素(和半纤维素)直接化学转化为高附加值产品(特别是燃料成份)的技术也在探索中( Miller et al.,1999 Huber et al.,2005; Ragauskas et al.,2006; Rostrup- Nielsen,2005),对促进木质纤维资源综合有效利用及提高生物乙醇技术的市场竞争力将大有助益。如图4所示,木质纤维原料可以生成多种高附加值的主产品和副产品(包括燃料添加剂、生物塑料、化学品等)。尽管酒精燃烧时产生的热木质纤维能比汽油低(酒精为22.1MJ·L'、汽油为34.3MJ·L1)( Nordin,1994),但酒精的辛烷值纤维素半纤维素比汽油高许多,是抗爆剂,又是CelluloseHemicellulose助燃剂,所以用汽油醇作燃料不用再添加四乙基铅或MIBE,就生物塑料化学制品可成为高标号燃料油,可减少空热电联产燃料添加剂清洁燃料气中铅的污染。Fuel additives5木质纤维生物转化乙醇工艺的优化氧化剂木质纤维生物转化乙醇技Methyl tertiary butyl ether术的发展是一个渐进的过程。高标 Premium93最初是从化学转化演变而来,即用酶解替代酸解,再进行发酵,图4木质纤维的综合利用即所谓的分步糖化发酵Fig. 4 Lignocellulose utilization( saccharification and fermentation,简称SF)法( Wilke et al.,1976)。SF法存在纤维素酶受葡萄糖( glucose)和纤维二糖( cellobiose)终产物抑制,酶解效果差、酶制剂用量大的弊端。因此,同步糖化发酵( simultaneoussaccharification and fermentation,简称SSF)法( Gauss et al.,1976)便应运而生。SSF法使水解( hydrolysis)与发酵( fermentation)两步合一,消除了SF法的弊端,提高了糖化效率随着遗传重组微生物技术的应用( Ingram et al.,1991; Zhang et al.,1998),以前无法实现的C/C3糖共发酵成为可能。日前相对比较成熟的是美国能源部的国家可再生能源实验室(NREL)推荐的同步糖化共发酵( simultaneous saccharification and cofermentation,简称SSCF)法。SSCF法把源于半纤维素的木糖等C3糖和源于纤维素的葡萄糖等C糖一道转化成乙醇,从而提高了转化效率降低了生产成本。在 NREL Model的应用中,通常用稀酸(≤1%H2SO)进行预处理,然后浆液的一小部分供送生产纤维素酶的微生物培养罐,其余流向发酵罐,同时加入纤维索酶和发酵微生物,实现同步糖化共发酵。通常绝大部分半纤维素在预处理过程中便被糖化,所释V凵中国煤化工发酵。图5是基于SSCF概念( NrEL Model)改进的并行糖化共发酵生产模型(工艺CNMHG将预处理释放的C糖化液并联发酵,以及对预处理后的残留物(主要含纤维素和木质素及少量半纤维素)进行同步糖化共发酵结论木质纤维原料Lignocellulos木质纤维生物转化乙醇是Cs糖发酵个动态发展、不断完善的技术。乙醇回收技术进步的核心方向(或最终目酶生产hanol recoveryEnzyme production的)是要降低生产成本,提高生物乙醇的市场(价格)竞争力基本策略是生物的(如工程菌和纤维素酶)和工艺的(如预处理,预处理综合利用,和系统集成)优化并同步糖化共发酵SSCE举,特别是生物的改进尚有较大固残余物处理的空间,而纤维素酶活性的提高Solid residual treatment是关键。优质高产抗逆C/C5木质纤维生物转化乙醇的并行糖化共发酵生产流程共发酵工程菌和产酶工程菌的Fig. 5 Optimized SSCF process for bioconversion of lignocellulose to ethanol开发所取得的进展,为木质纤维consolidated from NREL model and its various industrial modifications生物转化乙醇技术奠定了发展基础。就工艺而言,本文根据美国能源部可再生能源实验室(NREL)所推荐的SSCF Model进行概念性改进,提出了并行糖化共发酵生产模型。目前类似的生物转化模型已接近产业化(实用)阶段,但其运行成本和效率取决于多方面因素,应该避免盲目地照搬硬套。不过,可以谨慎乐观地预期,随着汽油价格的飙升和生产成本的下降,木质纤维生物转化乙醇技术将越来越显现其生命力和市场竞争力。参考文献Badger P C. 2002. 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