聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸的合成与表征

生物医学工程学杂志J Biomed eng2006;23(4):786~789聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成与表征杜建张晟张丽芳孙蕊熊成东^彭宇行(中国科学院成都有机化学研究所,成都610041)摘要以聚乙二醇单甲醚为原料在溶剂中与萘钾反应,形成聚乙二醇单甲醚的钾盐活性中间体,再与对甲苯磺酰氯反应得到聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯,进而反应生成氨基聚乙二醇单甲醚,并用此引发γ苄基-L-谷氨酸N-羧酸酐,生成嵌段共聚物聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸,然后用碱脱去苄酯保护基,得到水溶性的聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸。用红外光谱,核磁共振,凝胶渗透色谱对聚合物结构进行了表征。该嵌段共聚物在药物控制释放研究中具有重要的应用价值关键词氨基聚乙二醇单甲醚γ苄基-L-谷氨酸N-羧酸酐聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸嵌段共聚物Synthesis and Characterizations of Poly (ethylene glycolblock-poly (glutamateDu Jian Zhang Sheng Zhang Lifang Sun Rui Xiong Chengdong Peng Y uxing(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Academia Sinica, Chengdu 610041ChAbstract Amine-terminated poly (ethylene glycol )(PEG) was prepared by two steps. Firstly, potassiumnaphthalene was added to a solution of methoxypolyethylene glycol 5, 000 in benzene until thegreen in half of an hour, then excess tosylchloride was introduced secondly, the conversion of the tosylate into anamine was carried out by Gabriel synthesis. The block copolymer poly (ethylene glycol )-co-poly(y-benzyl L.lutamate ) could be obtained by ring-opening polymerization of y-benzyl-L-glutamate N-carboxy anhydride withamine-terminated PEG as macroinitiator. And the benzyl group could be removed by sodium hydroxide. Theproduct structure was characterized by IR, HNMR, GPC. The cisplatin-loaded micelle was observed bytransmission electron microscope(TEM ). And the block copolymer is expected to be useful as functional materialsincluding carrier systems in drug controlled delivery applications.Key words Amine-terminated PEG Y-Benzyl-L-glutamate N-carboxy Poly (ethylene glycol)-co-poly(glutamate acid) Block copolymer要使用有机溶剂,强力搅拌,和表面活性剂。这就使得那些易失活,不稳定的药物不可避免的存在失活在聚合物科学领域,无论是基础研究还是应用分解变性的现象。而且这类载体往往载药量较低,原研究,通过大分子自组裝形成超分子结构的新型功因是药物与载体之间是靠物理吸附和包裹作用结合能高分子都是研究热点之一。在这一领域中嵌段共到一起的因此,近年来人们开始对聚醚共聚物的结聚物特别是以聚醚为基础的嵌段共聚物引起了人构进行改性,引入带有活性基团的水溶性的链段,其们的特别关注。在聚醚与可生物降解高分子共聚材中八料研究得最多的是聚醚与可生物降解聚酯的共聚材物件H中国煤化工迷聚氨基酸两嵌段共聚CNMHG成方法上进行一些创新料,如聚醚一聚乳酸等-3。该共聚物能自组装成纳性探米粒子,但是这种纳米粒子在包裹药物过程中往往2试剂与仪器国家缪封数资助项目(50273041)聚乙二醇单甲醚(5000),邻苯二甲酰亚胺钾盐△通讯作者。E-mail:xcd@cioe.ac.cn三聚光气均购自 Sigma公司;对甲苯磺酰氯用苯将第4期杜建等。聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成与表征787其溶解,石油醚沉淀纯化,干燥;四氢呋喃,苯,1,4-气(过量10%),在60C下反应,待反应液变清亮后氧六环,石油醚均先经过预干燥,然后用金属钠回冷却至室温,加大量石油醚沉淀,然后用四呋喃重流脱水,直至二苯甲酮指示剂变为蓝色蒸岀;N,N-结晶三次,干燥,得白色疏松状固体,产率57.4%二甲基甲酰胺,三氯甲烷用五氧化二磷干燥η2h,3.3聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成使用前蒸馏;其它试剂均为国产分析纯。 NICOLET3.3.1聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸两嵌段共聚200 SXV FT-IR红外光谱仪,溴化钾压片; Varian物的合成将氨基聚乙二醇单甲醚和y苄基L-谷UNITYINOVA-400Hz核磁共振仪,以氘代氯仿为氨酸N-羧酸酐加入预先用氮气置换过的干燥反应溶剂; Waters Associates Model alc/GPC244凝瓶中,然后用注射器加入1,4二氧六环和氯仿的混胶渗透色谱,聚苯乙烯为标样,四氢呋喃为溶剂。合溶剂(3:2,v/v),使两种原料的总浓度为5%3实验部分(wt/y),在35C下搅拌反应72h后,加入大量甲醇沉淀得白色固体产物,产率63.2%3.1氨基聚乙二醇单甲醚的制备3.3.2聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸脱保护将3.1.1聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯的制备8乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸配成5%(wt/)的氯在干燥的充有氮气的反应瓶中加入聚乙二醇单甲仿溶液,加入过量的1molL的氬氧化钠水溶液,在醚和苯,待聚乙二醇单甲醚溶解后,加入适量的萘钾室温下搅拌反应30min,然后用盐酸将溶液pH值直至绿色0.5h不消失,然后加入过量的对甲苯磺调至中性,分液,得氯仿层和水层,将水层溶液用氯酰氯,室温反应24h,抽滤除去氯化钾,用大量乙醚仿萃取3次,然后把萃取液和氯仿层溶液合并,加大沉淀得到初产物。初产物再用乙醇重结晶,真空干量乙醚沉淀,真空干燥,得浅黄色固体,产率53%。燥,得白色固体,产率92.3%。3.1.2聚乙二醇单甲醚一邻苯二甲酰亚胺的制备4结果把聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯溶于N,N-二4.1氨基聚乙二醇单甲醚的制备甲基甲酰胺,加入过量的邻苯二甲酰亚胺钾盐,4.1.Ⅰ聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯的制备120℃,氮气保护搅拌反应3h,冷却到室温,过滤掉从其氢核化学位移上看,δ=4.18ppm为对甲苯磺未反应的邻苯二甲酰亚胺钾盐,乙醚沉淀,真空干燥酸酯基旁亚甲基的质子位移,δ=7.81ppm和δ=得白色固体,产率94.5%8ppm均为对甲苯磺酸酯基苯环上质子的化学3.1.3氨基聚乙二醇单甲醚的制备将聚乙二醇位移,说明羟基已转化为对甲苯磺酸酯,其羟基转化单甲醚一邻苯二甲酰亚胺溶于无水乙醇,加入过量率为97.5%。把原料聚乙二醇单甲醚和产品聚乙二的水合肼,回流反应4h,冷却至室温,大量乙醚沉醇单甲醚一对甲苯磺酸酯做凝胶渗透色谱分析,其淀,抽滤得固体产物。然后将产物溶于水,用氯仿萃数均分子量分别为3385和4002,分子量分布为取3次,萃取液用无水硫酸钠干燥1d,待氯仿液清1.06和1.05,该结果证实了在反应过程中分子主链亮后,滤掉硫酸钠,滤液用大量乙醚沉淀得到产物,基本没有发生变化将其用乙醇重结晶3次,真空干燥,得白色固体产4.1.2聚乙二醇单甲醚一邻苯二甲酰亚胺的制备物,产率82.5%其核磁共振谱显示:δ(CH2OTs)=4.18ppm消3.2y苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐的合成失,取而代之的是邻苯基二甲酰亚胺旁亚甲基的化3.2.1γ-苄基-L.谷氨酸的合成在单颈圆底烧瓶学位移δ=5.20ppm,另外,苯环的质子位移也由δ中加入L-谷氨酸,苯甲醇(比L-谷氨酸稍过量)和7.81ppm和δ=7.38ppm转移至δ=7.92ppm60%的硫酸(与L-谷氨酸等量),在π0℃减压脱水和δ-7.η1ppm,这说眀对甲苯磺酸酯已转化成为情況下反应5h,然后将反应物慢慢倒入內含碳酸邻中国煤化工氢钠的冷水中,不断搅拌,直到无气泡产生为止,在4.CNMHG謎谜的制备在其氢核化低温下使其结晶,将析出晶体过滤收集,用水和乙酸学位移屮:属」邻苯昼二中酰亚胺全部都消失了,并乙酯各洗3次,干燥后得白色固体,产率55.9%且在δ=3.18ppm处出现一个新峰,它归属于氨基3.2.2γ苄基-L谷氨酸N-羧酸酐的合成将γ-旁亚甲基的化学位移。红外光谱上也可发现苯环与苄基1谷氰秀氢呋喃加入到预先用氮气置换酰胶的特征峰都已消失,证明已经生成氨基聚乙过的干燥瓶中,继续加氮气保护,搅拌,加入三聚光醇单甲醚了。羟基的转化率为93.6%。经凝胶渗透788生物医学工程学杂志第23卷色谱分析氨基聚乙二醇单甲醚的数均分子量为ppm,δccH=5.12ppm)均已消失,而肽链上氢3360,分子量分布1.08,其结果证实经过一系列反原子的吸收虽然积分面积略有缩小,但变化不大;而应后,聚合物分子量基本未发生变化且凝胶渗透色谱上仍然只有一个单峰,所测得的分4.2聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸两嵌段共聚物子量与理论上脱保护后的分子量相差不大,这些均的合成表明苄酯保护基已成功被脱除且聚合物主链基本保从聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸的红外谱图持稳定。上可看到:1652cm-(u。)和1548cm-1(unNH)处肽键的特征峰,1733cm-1的苄酯峰和69cm和746cm-1单取代苯特征吸收峰,以及1111cm(υ。)聚乙二醇单甲醚的特征吸收,这些初步说明产物中聚乙二醇单甲醚组分和聚苄酯谷氨酸组分的存在。然后通过其氢核化学位移得到证实:聚乙二醇单甲醚重复单元中亚甲基质子的特征峰(δ O-CH.CH,o=3.41-3.83ppm),聚谷氨酸链段上次甲基氢核的特征峰( (CO-CHR-NH)=4.39ppm),以及苄基苯环上氢核和亚甲基氢核的化学位移(δcH7.38pm和6cH2c)=5.12pm),说明产物中ppt 8确实存在聚乙二醇单甲醚和聚苄酯谷氨酸链段。最后我们对聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸进行了凝2聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸的氬核化学位移Fig 2 ' HNMR spectral data of MPEG-PGA胶渗透色谱检测,结果发现谱图上只有一个对称流出体积峰(基本没有低分子量级份出现),且分布较5讨论窄,最终证实了嵌段共聚物生成的事实。4.3聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸的合成在第一步反应氨基聚乙二醇单甲醚的制备中在红外谱图中,酰胺在1652cm-和1549cm我们考虑到羟基的反应活性较低,处在大分子聚乙的特征吸收依然存在,而1733cm-的苄酯峰和690二醇单甲醚链端时,其活性不足以引发N羧酸酐开cm-1与746cm-的单取代苯的特征峰都基本消失环聚合,需要将其转化为较为活泼的氨基对甲苯磺了,说明脱保护成功(见图1)。酸酯基是一个很好的离去基团,因而我们把聚乙醇单甲醚一对甲苯磺酸酯用作聚乙二醇单甲醚衍生物的中间体。将聚乙二醇单甲醚转化为氨基聚乙100醇单甲醚,首先是把其转化成聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯,这步反应的转化程度也决定了最终产80物的氨基化程度,因此制备氨基聚乙二醇单甲醚的重点和难点就在于制备定量转化的聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯。聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯一般是在碱的催化下,用聚乙二醇单甲醚和对甲苯磺酰氯反应而得,主要有以下几种方法。(1)以干燥的聚乙二醇单04000333326662000166613331000甲中国煤化工1在二氯甲烷中,用吡啶做CNMH这种方法,羟基的转化图1聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸红外谱图率只有80%,且反厘辽中易发生聚合物链的断Fig 1 IR spectral of MPEG-PGA裂,反应时间也较长,产物不易纯化。(2)用丁基锂作为碱催化剂来制备聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸聚乙方劈轰醚聚谷氮酸的氢核化学位移(见酯此法虽然羟基转化率较高但其成本较高且后图2)可以看到属于苄酯氢核的吸收(cH=7.38处理复杂。(3)用氢化钠做催化剂,虽然聚合物链不第4期杜建等。聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成与表征789会断裂,但羟基转化率又不高。copolymer interactions for micelle formation: physicochemica本研究的创新之处在于用有颜色的萘钾,可根characterization. Journal of Controlled Release, 2001: 75: 249据颜色来判断聚乙二醇单甲醚的转化程度,当逐步Riley T, Stolnik S, Heald CR, et al. Physicochemicaevaluation of nanoparticles assembled from poly (lactic acid加入萘钾时,若溶液维持30min不变色则证明萘钾poly (ethylene glycol)(PLA-PEG) block copolymers as drug过量,在这种情况下,聚乙二醇单甲醚的末端羟基基delivery vehicles. Langmuir, 2001: 17: 3168本完全转化,这点可从其氢核化学位移上得到证实。3 Riley I, Stolnik s, Garnett M,ea. Use of viscoelastic而且本方法反应时间短,成本低,产率高,操作简便measurements for investigating interparticle interactions in接下来我们进行γ苄基--谷氨酸-N-羧酸酐dispersions of micellar- like poly (lactic acid )-poly ( ethylene的合成。谷氨酸是一种含有两个羧基的氨基酸,反应4 Nishiyama N, Yokoyama M, Aoyagi T, et al. Preparation and前需先用苯甲醇保护其中一个羧基,生成γ苄基Lcharacterization of self-assembled polymer-metal complex谷氨酸,然后再与三聚光气反应制得γ苄基-L-谷氨micelle from cis-dichlorodiammineplatinum II) and poly酸-N-羧酸酐(ethylene glycol )-poly (-aspartic acid) block copolymer in an随后我们用氨基聚乙二醇单甲醚作为大分子引queous medium. Langmuir, 1999: 1发剂引发γ苄基L-谷氨酸N-羧酸酐开环聚合。引Harada A, Kataoka K. Novel polyion complex micellesentrapping enzyme molecules in the core: preparation of发剂中端氨基的N上有未共用电子对,因此具有亲lysozyme and poly (ethylene核性,可通过亲核加成引发链增长生成嵌段共聚物。glycol )-poly(aspartic acid block copolymer in aqueous mediu最后脱去聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸的苄Macromolecules, 1998: 31:288酯保护基,即得到侧链含有羧基的聚乙二醇单甲醚6 Zhou SB, Deng XM. In vitro degradation characteristics ofere聚谷氨酸。一般的苄酯脱除常使用钯碳催化氫化的human serum albumin. Reactive and Functional Polyme方法,但我们在实验中发现:由于钯碳会对聚合物产生较强烈的吸附作用,会导致分离困难,产率低。考7 Kataoka K, Ishihara A, Harada a,eta. Effect of the虑到聚氨基酸链节中酰胺的稳定性较苄酯强的secondary structure of poly L-lysine segments on th多,我们采取了碱性条件下室温短时间处理共聚micellization in aqueous milieu of poly (ethylene glycol)-poly (L物的方法hydrocinnamyl group at the N-position. Macromolecules至此我们成功地合成了水溶性的聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸嵌段共聚物。当这种聚合物的水溶液8 Yuan MI,ⅹ Kiong CD, Deng XM. New sythesis of PEG-OTs与溶于水的药物相混合时,由于有羧基存在,能通过N98124012.7,1998袁明龙,熊成东,邓先模.聚醚对甲苯磺静电吸附、氢键等弱的作用力与药物结合,从而提高酸酯的合成新方法CN9812载药量。因此该嵌段共聚物在药物控制释放研究中(收稿:2004-03-25修回:2004-06-16)具有重要的应用价值。参考文献1 Go vender T, Stolnik S, Xiong CD, et al. Drug-polyionic block中国煤化工CNMHG