泽泻乙醇提取物的HPCE分离研究

第24卷第1期分析试验室Vol 24. No. 1Chinese Journal of Analysis laboratory泽泻乙醇提取物的HPCE分离研究马少妹“1王巧娥2李琦沈阳2王小如21广西民族学院化学化工系,南宁53000602.厦门大学化学化工学院现代分析科学教育部重点实验室,厦门361005)摘要采用高效毛细管电泳的胶束电动毛细管色谱的分离模式MEKC)对泽泻的乙釀95%湜取物进行分离研究。以十二烷基硫酸钠SS腋束为准固定相硼砂为缓冲体系甲醇为有机添加剂,考察了Ss浓度、硼砂浓度、p甲醇用量、电泳电压、电泳温度等对分离的影响。结果表明:硼砂缓冲体系为运行缓冲溶液pH⑨.18~9,20)硼砂浓度3mm/lSs浓度45mmo/1甲醇体积分数30%分离电压25kV分离温度25℃时分离效果最好。在此条件下得到分离度和重现性均较好的泽泻乙醇提取物的HPCE色谱图。关键词泽泻胶束电动毛细管色谱汾离中图分类号x657.8文献标识码:文章编号:0072200501-000603泽泻是一味常用中药有利水湿、化痰饮、降火械厂)泽泻药材采于福建建瓯经鉴定为泽泻科气、去湿热、补阴益气等功效门历经300多年至泽泻属植物 Alisma orientalis(Sam.) Juzep.十二烷今仍具有诱人的开发前景,为世界医药学所关注。基硫酸钠(色谱纯, sigma公司),NaH2PO4NaOh目前泽泻主要以23-乙酰泽泻醇B为质控指标采硼砂无水♂醇均为分析纯。23-乙酰泽泻醇B24用薄层扫描泫LCλ高效液相色谱汯HC对其乙酰泽泻醇A〔南京中医药大茡植物药深加工工质量进行评价23程研究中心高效毛细管电泳HPCE)前正广泛应用于中1.2实验方法草药指纹图谱的研究45廴本文采用高效毛细管1.2.Ⅰ分析液制备将泽泻的干燥块根粉粹过电泳的胶束电动毛细管色谱的分离模式对泽泻的250{m筛混合均匀后准确称取5.0g,置于50乙釀95%湜取物进行的分离研究得到了分离度mL曆口瓶锥形中加25mL95%乙醇超声提取2和重现性均较好的泽泻药材的HPCE色谱图谱,为次每次30min。提取液合并离心分离取上清液建立泽泻药材HPCE指纹图谱库提供实验方法和为分析液。依据从而为全面评价泽泻药材的质量提供参考。1.2.2HE分离按要求配制实验用操作缓冲实验部分液运行前超声脱气15min。毛细管柱使用前依次1.1仪器与试剂用0.1mol/ L NaOH和水及缓冲液冲洗5min然后HP3DCE型高效毛细管电泳仪(美国惠普公在运行电压下平衡30min以后每次进样依次用司),石英毛细管(60cmⅹ巧5ⅧmX河北永年光纤乙醇、水、0.1mo/ L NaOH溶液和水及缓冲液冲洗厂)828型pH测试仪美国 Orion公司)SK320H3min进样前在运行电压下平衡5min本实验采超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司),M-用压力进檥(250kPa),二极管阵列DAD)检测器CRO2R台式冷冻离心机 Hettich ) MilliQ超纯水装检测检测波长202mm置JD-06A型高速中药粉碎机温岭市大海药材器收稿日期2003-08-17修订日期2004-04-19第24卷第1期分析试验室ol.24.No.12005年1月Chinese Journal of Analysis laboratory2005-12结果与讨论pH大于10,迁移时间延长分离效果也不好。为2.1提取溶剂的选择确定最佳的硼砂溶液浓度、pH和SDs浓度以色谱据文献报道6泽泻的主要药效成分为三萜醇优化函数-COμ7(其值取决于所有峰的分离度)酮类化合物易溶于醇类等有机溶剂。制备分析液作为评价指标分离度小于1作为0处理峰高表时分别采用无水乙醇、95%乙醇无水甲醇、95%示响应值的大小)在检测波长202mm,分离电压甲醇、乙腈、95%乙腈等溶剂进行提取结果表明以25kⅤ工作温度25℃,甲醇体积分数为30%的条95%乙醇、95%甲醇提取效果为佳。考虑到甲醇的件下进行了三因素三水平正交试验方案I34)毒性最后选用95%乙醇为提取剂。正交实验的因素、水平以及结果见表1和表2。2.2毛细管电泳分离条件的选择根据正交试验结果表1)通过方差分析和显2.2.1毛细管电泳模式的选择泽泻乙醇提取物著性检验得岀因素A即SS浓度对分离效果影大部分是难溶于水的中性分子故选用MEKC非响最显著因素C即硼砂浓度次之因素B即pH水毛细管电泳模式分别进行试验結果表明MEKC最小表2)在此基础上进行了扩展试验最终得的分离度优于非水毛细管电泳。出分离泽泻乙醇提取物的最佳HPCE条件为:SDS2.2.2缓冲试剂的选择毛细管的电渗流EOF)浓度为45mmo/L硼砂浓度30mmol/LH9.20,是MEKC技术的基础。由于实验过程选择表面活甲醇体积分数30%分离电压25kV、分离温度2性剂Ss为准固定相因此只有在中性或碱性条℃。件下才能确保胶束最终从负极经过检测器一端)2.3重复性试验流出。如果p过小胶束向正极运动的速度大于在最佳缓冲体系和电泳条件下对同一样品进EOF速度而无法分离如果pH过大EOF增大,可行1天内连续3次和连续2天检测得到迁移时间能会使样品中的组分未完全分离就被洗脱出系统。的日内和日间相对标准偏差(RSD)分别为0.31%据此选择了磷酸盐和硼砂缓冲体系进行试验结和o.43%;峰面积旳日內和日间相对标准偏差果表明弸砂缓冲体系优于磷酸盐缓冲体系。(RSD玢别为0.65%~0.72%和0.97%~1.04%2.2.3甲醇用量在本实验中,甲醇的主要作用各峰面积与样品浓度成正比。通过内标法对23-乙是增溶。实验发现甲醇的体积分数小于⑩0%时,酰泽泻醇B24-乙酰泽泻醇A进行定性从图1可分离效果不好且毛细管容易堵塞而甲醇的体积分数大于40%时分离效果也不好这可能是甲醇表1正交试验方案与结果量过多影响胶束的形成从而影响分离效果。甲Tab 1 Arrangement and results of orthogonal experiment醇的体积分数为30%时可获得满意的分离。因素A因素B因素C实验2.2.4电泳电压的选择采用了17、20、23、25序号)浓度硼砂浓度电渗流8、30kV不同的分离电压进行实验结果发现随cA mmol/L) pH c/( mmol/L)着电压的增大分离时间缩短但电压越高分离度3(1)8.(1)151)30.96越低。综合考虑选择25kV为分离电压3(1)9.02)252)53.631)9.53)353)2.2.5电泳温度的选择实验观察了分离温度为2)8.1)22)5220、23、25、28、30℃时的迁移时间和分离效果。结3(2)9.02)353)果发现温度对迁移时间和分离效果的影响均不明32)9.53)1(1)41.显。所以选择接近室温的25℃。40(3)8.51)353)2.2.6硼砂溶液浓度、pH和SDs浓度的选择根40(3)9.02)151)61.99据初步的实验结果翮砂溶液浓度、pH、SDs浓度对40(3)9.53)2(2)64K1340.8646HPCE分离影响显著。当SDs浓度小于35mml/L时23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻A不分离。当K3/349.32SDS浓度大于50mmol/L时或硼砂浓度大于409.22l1.91组合第24卷第1期分析试验室Vol 24. No. 1Chinese Journal of Analysis laboratory表2方差分析表Tab 2 Variance analysis方差来源平方和自由度均方差显著性613.62306.81117.69153.51218.08109.04误差)K总和)990.4FC,.)Foo22)=99F0o(22)=19tionalities, Nanning 530006), WANG Qiao-e, LI QiSHEN Yang and WANG Xiao-ru( The key Laboratory ofAnalytical Science of Moe, Xiamen University , Xiamen361005), Fenxi Shiyanshi,2005,241):8~10Abstract: The separation of the compounds extractedfrom rhizoma of Alisma orientalis( Sam. Juzep usingary chro-matography MKCC ) with sodium dodecyl sulphate( SDS )as the micellar phase borax as a buffer and图1泽泻药材的毛细管电泳谱图methanFig. I Electrophorograms of alisma orientalisas an organic additive was studied, which es-1-24-乙酰泽泻醇A;2-23-乙酰泽泻醇Btablished a fingerprint technique for the rhizoma of Alisma orientalis. The effects of sds micellar and borax看出24-乙酰泽泻醇A较23-乙酰泽泻醇B先洗脱 concentration, pH buffer, methanol volume fraction,p出来plied voltage and temperature on the separation werevestigated by the orthogonal test using chromatography参考文献optimization function( COF )as the evaluation index. It[1]中华人民共和国药典[M]北京:化学工业出版社. was found that the optimal separation conditions of these2000.184components might be achieved by using a fused silica[2]彭国平潘林梅文红梅.南京中医药大学学报(自然 capillary with60 cm long and75mm, in which30科学版)2001,K3):154mmol/L borax buffer solution( ph 9. 20) containing 45[3]文红梅李伟彭国平.中药材,9982K12)595mmol/L SDS and 30 methanol was filled under the[4]谢培山.世界科学技术一中药现代化2001x3)18voltage of 25 kV and a temperature of 25 C, HPCE fin-[5]王天松.中成药20002x6)397gerprint of the rhizome of Alisma orientalis with perfect[6]龚树生张建军,曹广智等.山西中医学院学报,a2000(1)28;b.K2)22separating size and repeatability could be expected[7]吴惠芳关福玉罗毅.分析化学19962410):11Thus the method provides a basic information for thewhole quantity control of the rhizoma of Alisma orientalisSeparation of ethanol extract of Rhizoma of Aln the productsisma Orientalis by High Performance Capillary elec. Keywords: Alisma orientalis; Micellar electrokinetictrophoresis( HPCE MA Shao-mei( Department of capillary chromatography ; SeparationChemistry and Engineering, Guangxi University for Na-