甘蔗块固定化酵母的制备及其在蔗汁燃料乙醇生产中的应用

甘蔗块固定化酵母的制备及其在蔗汁燃料乙醇生产中的应用梁磊1,张远平2,朱明军1,梁世中11(华南理工大学大学生物科学与工程学院广东广州,510006)2(广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室,广东广州,510316)摘要以甘蔗块为载体固定酵母细胞,通过优化载体大小和预处理方式,制备得到性能优良的固定化酵母,应用于蔗汁燃料乙醇的生产。研究结果表明,大量酵母细胞固定于甘蔗块内部空腔以及吸附于甘蔗块表面;较小的甘蔗茎埉作为固定化载体,乙醇产率增加10%左右;冷冻储存的甘蔗块经过解冻、去木质素处理后固定酵母以40%的装壤率发酵36h,乙醇浓度达99.34g/L,糖利用率为99.23%发酵效率为93,09%关键词固定化酵母,甘蔗块,燃料乙醇固定化细胞发酵技术有许多突出的优点:由于它1.1.1菌种大大增加了细胞浓度,增强了菌体对外部条件如温度酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)和酸碱度的抵抗能力;缩短了发酵周期,提高反应器AS2.1190,广州甘蔗糖业研究所保藏。单位体积的生物转化速率;而且由于细胞被固定,减1.1.2培养基少了细胞流失,细胞可长时间反复使用,并有利于产(1)种子培养基(YPD)葡萄糖20g/L,酵母粉物分离等。这为发酵的连续化和规模化提供了方便。10g/L,蛋白胨20g/L,121℃灭菌15min目前固定化细胞技术己经在食品工业、环境保护、能(2)发酵培养基:取堆放3d内的新鲜甘蔗(品源开发等方面得到广泛的应用。酒精酵母细胞固种:0026,广州甘蔗糖业研究所湛江甘蔗育种基地提定化大部分采用海藻酸钠聚乙烯醇(PVA)等包埋供),榨汁过滤后,121℃灭菌15min,但存在成本较高、固定化过程较繁琐且对细胞有(3)甘蔗块:新鲜的甘蔗茎经清洗去皮后,切成块损伤载体软化现象等缺点口2.探索新的固定化载体状,-20℃保存和固定化方式,营造更适合细胞生长和代谢的环境是.,2主要仪器设备固定化技术发展的方向。各种天然材料,如水果块、小型甘蔗榨汁机;酒精比重计;SHP-2500型生麸皮去木质素的纤维素残渣,都曾作为固定化载体化培养箱;SGD-I型全自动还原糖测定仪;SKY被成功应用于酿酒和乳清发酵等食品相关工业13-5)。2102型摇床;R205210型双层立式蒸汽压力消毒器;本文利用甘蔗茎块中天然的细胞纤维间隙和纤BA2000双目显微镜;血球计数板; HITACHI S维素自身对酵母的吸附作用,有利于酵母吸附并在其300N型电镜内部生长的特点制备固定化酵母并利用其发酵甘蔗1.3方法汁生产酒精。主要探讨了甘蔗块固定化酵母的制备方法,并对其制备条件进行优化,确定了最佳载体大1.3.1甘蔗块的预处理将甘蔗去皮后切成块,按5种不同方式处理,第小、材料的预处理方式、酒精发酵时固定化酵母的装填率。研究结果为能源甘蔗燃料乙醇的实施奠定技1组不做处理;第2组用1%NaOH浸泡4h去木质素3,并用磷酸调pH至中性;第3组置于冷冻干燥术基础。机中进行冷冻干燥;第4组冻融处理;第5组冻融处1材料与方法理后进行去木质素处理11材料1.3.2固定化酵母的制备取适量处理后甘蔗块,加入YPD培养基中,灭菌第一作者:博士研究生(张远平高级工程师为通讯作者)养至对数牛长期的酵母种子液,置于30℃“广东省科技计划项目(No200B10501003),广东省科技攻关项目(No.20064990055)转速中国煤化工收稿日期:2008-11-24,改回日期:2008-12-161.3.CNMHG将制备好的固定化酵母按照一定接种量(装填2009 VoL 35 No 2(Total率)接入150mL蔗汁培养基,静态发酵。每2h称量糖利用率/%x初始糖(g)X残糖(g×100(3)发酵液的CO2失重情况,直至重量恒定即发酵结束初始糖(g)发酵初始时测定发酵液中的总糖含量,发酵结束后测2实验结果与分析定发酵液中的乙醇含量和残糖量。1.3.4酵母细胞数的测定2.1酵母固定化的电镜观察将10g蔗块固定化酵母浸入90mL已灭菌的由图1可知,甘蔗的薄壁细胞、维管束等组织结1/4格氏试剂( Merck, Germany)中,100r/mn振荡构经预处理后,形成很大的空腔(图1A),有利于大量30min,梯度稀释后,血球板计数。同样,分别取1酵母在其内部生长素殖(图1B).同时大量的酵母细mL固定化酵母发酵和游离酵母发酵结東后的发酵胞被吸附固定于甘蔗块的表面(图1C),说明蔗块天液加于99mL已灭菌的1/4格氏试剂中,梯度稀释然的细胞纤维间隙和纤维素自身对酵母具有良好的后,血球板计数固定化作用,固定化过程兼具吸附作用和包埋作用的1.3.5酵母固定化情况电镜观察特点1.3.6发酵液中还原糖的测定切1.3.7发酵液中乙醇浓度测定B1.3.8CO2生成速率(dCO2/dt)计算CO2生成速率/g·bx重量,(g)=重量-2(g)2(h)图1甘蔗块固定化酵母电子显微镜照片(1)22载体大小的确定1.3.9酒精发酵效率的计算将甘蔗去皮后切成长度分别为1cm2cm2cm发酵效率/%酒精度(g)初始糖(g)×残糖(g)]X0.5×100中空1cm3种大小,按1.3.2方法制备固定化酵母,按1.3.3方法进行发酵实验,结果如表1所示1.3.10糖利用率的计算饔1载体大小对固定化酵母酒精发酵的影响甘蔗茎块长度体积表面积总表面积残糖浓度乙醇体积分数发酵效率糖利用率/cm3/cm"(20℃)/%5.3019.90150.21.3711.202.3610.4287.12.0(中空直径1cm)23.55由表1结果可知,在相同条件下,3种大小甘蔗实验。块发酵效果比较:2cm中空>1cm>2cm。lcm长2.3,1预处理对CO2生成速率的影响蔗块的乙醇产率比2cm长蔗块增加10%左右,因为小蔗块的总表面积比大蔗块增加40%以上,基于营一冻融处理对照(无处理)养吸收和代谢产物扩散因素,在蔗块内部,酵母集中在靠外表面的一侧,大蔗块中心部分酵母的密度很一冻融+去木质素处理低,形成所谓死亡区域所以小蔗块发酵乙醇产率较高。将2cm长的蔗块中心部位挖去一直径为1cm的圆形部分,则可以大大增加甘蔗块的表面积进而0816243244856改善固定化效果。由于2cm中空和1cm发酵效果发酵时间h相差不大,基于制备工艺简化原则选取1cm蔗块作图2载体材料预处理方式对dCO2/dt的影响为载体。由中国煤化工质素处理组CO22.3载体材料预处理生成速CNMHG率达到085g按131方法处理蔗块按133方法进行发酵h209年第58菊2(总254题)7一2%8预处理方式酒精含量发牌时间h图3载体材料预处理方式对乙醇体积分数的影响图4载体装填率对dCO2/dt的影响2.3.2预处理对固定化和发酵效果的影响由表2可知,在一定范围内,乙醇体积分数随固由图3可知,对载体材料进行适当的预处理,将定化酵母装填率的升高而升高,装填率为40%时,乙有效提高固定化效果和固定化细胞的催化效能。固醇体积分数达到最高99.34g/L,发酵效率为930定化细胞个数和乙醇体积分数由高到低依次为,冻融9%;而当固定化酵母装填率大于40%时,乙醇得率去木质素处理组>去木质素处理组>干燥处理组和发酵效率几乎保持不变。由此可知,在甘蔗块固定>冻融处理组>对照组。冻融处理结合去木质素处化酵母发酵甘蔗汁生产乙醇的过程中,在一定的固理的蔗块,固定化效果和发酵效果最好原因可能为定化酵母装填率以下,发酵效果受装填率的影响较冻融处理和去木质素处理后蔗块内部的空腔面积增大,而当装填率达到一定程度时,固定化酵母的装填加,而且吸附作用增强,固定化细胞能力提高进而改率对发酵效果的影响不显著。原因可能由于一方面善发酵效果固定化酵母的装填率低于一定值时,固定化酵母越2.4载体装填率的确定多,酵母细胞对于甘蔗汁中的糖分的利用率越充分2.4,1载体装填率对CO2生成速率的影响因而增加装填率,有利于乙醇发酵;另一方面,当发酵按1.3.3方法,比较不同固定化载体装填率对过程中固定化酵母的装填率大于一定值时,固定化酵CO2生成速率的影响。由图4可知,发酵过程中的母处于饱和状态,发酵过程中的物质传递受到限制,CO2生成速率随固定化酵母载体装填率的升高而升甘蔗汁中的总糖分一定因而继续提高装填率对乙醇高发酵的效果影响较小2.4.2载体装填量对发酵效果的影响2載体装填量对固定化酵母乙醇发酵的影响装填率初始糖浓度/g残糖浓度/g·L1乙醇质量浓度/g·L发酵效率/%糖利用率/%189.702.1989.7198.8430189.7091.241.4693.0999.23189.701.62由表2可知,在一定范围内,乙醇体积分数随固因而增加装填率有利于乙醇发酵;另一方面当发酵定化酵母装填率的升高而升高装填率为40%时,乙过程中固定化酵母的装填率大于一定值时,固定化酵醇质量浓度达到最高99.34g/L,发酵效率为930母处于饱和状态发酵过程中的物质传递受到限制9%;而当固定化酵母装填率大于40%时,乙醇得率甘蔗汁中的总糖分一定因而继续提高装填率对乙醇和发酵效率几乎保持不变。由此可知在甘蔗块固定发酵的效果影响较小。化酵母发酵甘蔗汁生产乙醇的过程中,在一定的固定化酵母装填率以下,发酵效果受装填率的影响较3结论大,而当装填率达到一定程度时,固定化酵母的装填(1)蔗块可作为固定化酵母的载体用于蔗汁乙醇率对发酵效果的影响不显著。原因可能由于一方面生中国煤化工固定化酵母的装填率低于一定值时,固定化酵母越CNMHG响来看,甘蔗茎块体多,酵母细胞对于甘蔗汁中的糖分的利用率越充分,积小,总表面积大,发酵效果较好基于制备工艺简化78 2009 Vol 35 No. 2(Total原则采用截面直径为1cm的蔗块作为固定化载体。nified spent grains as yeast supports for alcohol production3)从载体的处理方式对发酵的影响来看预处 om molasses [. Bioresource Technology,207,98(7)理有利于固定化和发酵,无论是CO2生成速率还是1440~1447乙醇体积分数冻融+木质素处理的载体固定化效果4 Kourkoutas Y, Xolias V, Kallis M.etal, Cell immobilization on fruit pieces for probiotic additive, fermented较好。milk and lactic acid production[J]. Process Biochemistry.(4)从装填率对发酵的影响来看,一定范围内装2005,40:411~416填率越高CO2生成速率也越大,40%装填率的发酵5 Plessas P, Bekatorou A. Use of Saccharom yces cerevisia液中乙醇体积分数最高,故选择40%的装填率较为Cells Immobilized on Orange Peel as Biocatalyst for Aleo-合适。holic Fermentation[]. Bioresource Technology, 2007, 98,860~8656 L1张超王立高虹,等,固定化细胞应用进展[].微生物学sugarcane pieces as yeast supports for ethanol production杂志,2006,26(4):82~84from sugarcane juice and molasses[J]. Journal of Industri-2 Kiran N Sree, Sridhar M, Venkateswar L Rao. High al-al Microbiology Biotechnology DOI:10.1007/s10295cohol production by repeated batch fermentation using an008-0404-zimmobilized osmotolerant Saccharomyces cerevisiae].7楚杰王德源杨艳张利群等.还原糖测定仪的应用[Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2000山东食品发酵,2003,4:42~438梁磊张远平,梁世中,等.高酵母接种量的抑菌特性及其3 Nikolaos Kopsahelis, Nikolaos Agouridis, Argyro Beka在蔗汁生产乙醇中的应用[J].食品与发酵工业,20073torou, et al. Comparative study of spent grains and deli(12):1~4Preparation of Immobilization Yeast with Sugarcane andIts application for Alcohol ProductionLiang Lei, Zhang Yuanping, Zhu Mingjun, Liang Shizhong1(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)2( Guangdong Key Laboratory of Sugarcane Improvement and Biorefinery, Guangzhou SugarcaneIndustry Research Institute, Guangzhou 510316, China)aBSTRact A novel catalyst has been prepared with sugarcane as the carrier, in which the carrier shapeand size were optimized and materials pretreatment was investigated. The immobilized yeast was applied toproduce fuel ethanol with sugarcane juice. It has been observed that yeasts can be fixed in the sugarcane car-rier by electron microscope. The fermentation experiments indicated that the ethanol production using immo-bilized yeast with l cm length carrier was about 10% higher than that of with 2 cm length carrier. Frosteddefrosted and delignified, the immobilized sugarcane pieces were added by 40%(/v)in the sugarcane juicefor 36h fermentation, which showed that the yield of ethanol was 99. 34%, the sugar utilization was 99,23%and the fermentation efficiency was 93. 09%.Key words immobilized yeast, sugarcane piece, fuel ethanol中国煤化工CNMHG年35卷2期(总第254期)79