聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化

50生物技术2011年21(3)1.7 :1.61.5-1.4丰1.3-.2手1.1日1.0拿=0.0.8-0.0010.010.1i01001000Concentrationy=(A-DV(1+(/G)+D:ABCD。STD(Standarda 美国对照:Concentration vg Men...0.94 .0.7015611.6660.9980.910.5971.131.6610088。Plot#2( Sample 2 2091111:Concentration vs Me...0.9607591.2910.99。Plot#3( Sample 3 209111:Concentration vs Mes..0.940.5821 838團6纯化的 rhKCF的活性测定与对照品的对比图Fig.6 The mitogenie activity of purified rKCF compared with control国内外报道的KGF的纯化方法大多利用肝素亲和层析对测方法的建立将为该因子的进一步研究和临床应用提供良好rhKGF进行有效的提纯。但是考虑到肝素亲和层析介质不能基础。耐受高pH,不适合工业化生产。我们根据hKGF等电点大于参考文献:7.而菌体蛋白大多小于7的特点，通过一步阳离子交换层析， [1]erey s. Rubin, Hioyuki Oad, Peul w. Finch, e al. Puifcationn对thKGF和菌体蛋白进行有效分离。这样,不但省去了不适and characteization of a newly idenified growth factor speeifie for epithelial合工业化生产的肝素亲和层析,而且简化了纯化步骤，提高了cells[ J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,1989, 186 :802 - 806.纯化收率,总收率达到了每升发酵液50mg以上。通过- -步离[2]harmaprojet数据库(2011年更新).[3]Dina Ron, DonaldP. Botaro, Paul w. Finch, et al. Expression of bio-子交换层析实现rhKGF的高效纯化还未见报道。KGF的活性专-性比较强,主要限于上皮性细胞,寻找-logically acive recombinant keratinocyte growth factor[J]. The Journal of种专一的、敏感的检测细胞一直是目前的研究热点。我们通过Biologicacl Chemistry ,1993. 4(268) :2948 -2988.筛选,获得了一种与文献报道不同国,对rhKGF较为敏感的细[4]安姆根有限公司.角化细胞生长因子的纯化方法[P].中国:1161380C. 1995 - 10-12.胞-貂肺上皮细胞Mv-1- lu,初步建立了hKGF生物学活[S]邓林，刘孝菊，龚守良，等，重组截短型人角质细胞生长因子-1性检测方法。经检测,纯化的rhKGF能刺激貂肺上皮细胞Mv的表达及纯化[J].吉林大学学报,2010 ,36<4) :629 -633.-1 - Lu的增殖,具有显著的促有丝分裂活性,生物学活性与[6]蔡祥胜.重组截短型人角质细胞生长因子( rhKGFdesl -23)的克隆美国对照品Kepivance"相当。表达和活性[ D].北京:中国人民解放军军事医学科学院,007.本研究建立了一种适合产业化生产的制备高纯度hKGF[7]许莉妍.角质细胞生长因子(KGF)的表达及其生物学活性研究和的工艺和有效生物学活性的检测方法。该工艺具有表达水平成纤维细胞生长因子受体(FCFR)抑制剂稳定转染筛选模型的建立高、工艺简便、回收率高、产物活性高等特点。制备工艺和检[D].厦门:厦门大学,2009.聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化仇燕,李朝炜,苗芳(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄050018)摘要:目的:探讨聚乙二醇诱导鸡红细胞融合最适条件。方法:以鸡红细胞为材料,聚乙二醇为诱导剂，从细胞密度、融合温度聚乙二醇浓度及反应时间进行单因素实验,并设计3因素3水平的正交实验计算细胞融合率。结果:鸡红细胞融合的最佳条件是:细胞密度为2x 10°个/ml .聚乙二醇浓度为35% ,反应温度为35"C中国煤化工33. 06%。关键词:细胞融合;鸡红细胞;聚乙二醇MHCNMHG中图分类号:0813.2文献标识码:Adoi : 10.3969/j. issn. 1004 -311X. 2011. 03.074Optimal Condition of PEG - Induced Chicken Red Blood Cells FusionQIU Yan,LI Zhao - wei, MIAO Fang2011年21(3)生物技术51(College of Biological Science and Engineering, Hebei Univerity of Science and Technology ,hjiachuang 050018 ,China)Abstract:Objective:To find the optimal condition of chicken red blood cells fusion with PEG ( Mw= 4000) as the revulsant. Method:The effects of diferent cell density , fusion temperature, PEG concentration and reaction time on cell fusion rate were studied. Three fac-tors and three levels of orthogonal test were designed to attain the best cell fusion condition. Result: The most appropriate condition forcell fusion was cell density 2 x 10*/ml, 35% PEG, 35 centigrade and 40min. Conclusion: Under this condition, the highest cell fusionrate reached 33. 06%.Key words:cell fusion; chicken red blood clls; PEG细胞融合( cell fusion)又称细胞杂交,是指用人工方法使1.2.2 细胞融合两个或两个以上的细胞融合成-一个异核体细胞的现象。细胞采用血球板计数法将已洗涤纯化的鸡红血细胞悬浮液稀融合技术一方面为脊椎动物肌生成.炎症反应"、抑制肿瘤[2)释成不同的密度,取1ml细胞悬液于离心管,放人水浴锅中预及基因定位['等理论领域研究提供有力的手段;另-方面也热,同时将不同浓度 PEG溶液放人水浴锅中预热。待温度恒是制备单克隆细胞株及动植物远缘杂交育种方面的重要技定后 ,在1ml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml PEG溶液(慢慢术。依据融合过程采用的助溶剂的不同,细胞融合可分为:①沿离心管壁流~下融合剂)，且边加边摇匀,然后放人不同温度生物法:病毒诱导的细胞融合,如仙台病毒;②化学法:化学因水浴锅中。 细胞融合- -段时间后 ,加入GKN溶液至8ml,静止子诱导的细胞融合,如聚乙二醇( PEG) ;③物理法:激光、电脉于水浴锅中20min左右。取出离心管,2 000r/min离心3min,冲诱导的细胞融合。中PEC介导细胞融合法是最简单最常使 细胞完全沉降。弃去上清液，加入GKN溶液至8ml,再离心用的方法,由于操作简便,不需复杂仪器,融合效果好(4.)等优1次。染色弃去上清液,用手指轻弹底壁使沉淀松散,加入少点成为本科生细胞生物学实验课中的首选方法。传统教材中量GKN溶液,混匀,取少量悬液于载玻片上,加入Janus green的融合条件为:细胞浓度常选用2x 10个/ml,融合条件为B 染液,用牙签搅匀,染色3min后盖上盖玻片,观察细胞融合30心,50% PEC( MW = 40)介导反应10 ~ 15minloi。但在该情况。实验条件下细胞融合率较低,计数困难。为此,本实验在单因1.2.3 单因素实验素试验的基础上设计正交试验对融合率进行了全面系统比1.2.3. 1不同细胞密 度对融合率的影响较,以优化PEC介导细胞融合的反应条件。将10%细胞悬液(经血球计数器计数此细胞悬液密度为1材料与方法.2x10个/ml)分别稀释10倍、20倍.40倍和100倍。1ml不1.1 材料.同浓度细胞悬液预热后,慢慢逐滴加入0. 5ml预热后的50%1.1.1 实验材料PEG溶液(慢慢沿离心管壁流下),且边加边摇匀,然后放入.鸡全血,市购。30C水浴锅中20min,余下步骤同1.2.3。1.1.2试剂1.2.3.2不同融合温度对融合率的影响PEC4000为分析纯(25% .35% .50% .75% ) ,美国Biobas-取1.2.3.1中融合率最高的细胞悬液1ml ,将慢慢逐滴加ic公司;Alsever液0. 85%生理盐水、GKN液Janus green B染人0.5ml预热后的50% PEG溶液然后放入不同温度(30C、液。35C、37C、39C )水浴锅中20min,步骤同上。1.1.3 仪器1.2.3.3不同浓度 PEC对鸡血细胞融合率的影响TDL-60B离心机(上海安亭科学仪器厂);倒置显微镜向1ml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml不同体积分数(Nikon ELIPSE E200) ;HH -2水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有PEG 溶液(25% .35% .50%、70% )随后放入35C水浴锅中反限公司)。应20min,步骤同上。1.2 方法1.2.3.4不同反应时间对 鸡血细胞融合率的影响1.2.1鸡血红细胞悬液的制备1ml鸡血细胞悬液加入0. 5ml 35% PEC溶液,35C融合不参照文献[7]制备鸡血与Alsever 液体积比为1:4的悬同时间(20min .30min .40min、50min、60min)。液,取1ml鸡血悬液,加入4ml 0. 85%生理盐水，混匀平衡后，1.2.4正交实验800r/ min离心3min,弃去上清液,再按上述条件离心2次。最在结合上述单因素实验的基础上,对影响细胞融合的各后,弃去上清液,收集离心沉淀的血细胞,加入4mlGKN溶液因素,即PEG浓度融合时间及融合温度进行三因素三水平正混匀后离心1次。弃去上清液,加GKN液(体积比1:9),制成交实验(如表1)。10%细胞悬液。表1_正交设计试验的因素与水平ab. |中国煤化工收稿日期:2010 -11 -23;修回日期:2011 -03 -18YHCNMHGin)融合温度(C)资助项目:河北科技大学理工学院教研项目(2009Y05) ;河北科技大学教研项目(2009 - YB010)资助30作者简介:仇燕( 1977 -),女,河北井陉人,博士,副教授,研究方向:细240胞生物学与分子生物学，发表论文20篇, Tel:0311 - 88632198 , Email:5037qiuyan77@ yahoo,. comn. cn。52生物技术2011年21(3)1.2.5融合率的计算范围内的实验结果,见图2A。由图2A可知.细胞融合率随细每组反应条件制备3张装片,每张涂片随机选取3个视胞密度的增大而增高,10%细胞悬液稀释10倍时即细胞密度野分别置于40倍显微镜中,计数其中已发生融合的细胞核及为2x10*个/ml细胞完整，相邻及融合的最多,融合率达未融合细胞核数,求平均值,计算融合率(81。10. 3% ,而10%细胞悬液用于融合反应时.细胞密度过大,无融合率=视野内发生融合的细胞核总数/视野内所有细法计数(结果未列出)。因此将2 x 10个/ml作为融合最佳细胞核总数x 100%胞密度。2结果与分析2.2.2融合温度对融合率的影响2.1鸡 血细胞融合过程的观察由图2B可知,细胞融合率随着反应温度的升高而增加，显微镜下可见细胞融合过程中两个细胞逐渐靠近(图37C时细胞融合率最高达 20.15% ,并发现有少量细胞的细胞1A) ;两个细胞的细胞膜接触.粘连;接触点可能由于脂类分子膜破裂,可能是由于随着温度升高,膜流动性加快,有利于细发生疏散使得细胞膜破溃(图IB) ;两个细胞的细胞质相互沟胞融合的进行。但温度过高时,容易造成细胞膜的破损且融通,形成细胞质通道,细胞内物质通过这种通道得到转移,两合率下降，故将35C作为最适反应温度。2.2.3 PEG 浓度对个细胞连成一体(图1C)。融合率的影响2.2 单因素试验PEG具有一定的毒性,且其浓度越大对细胞的毒性越大，2.2.1细胞密度对融合 率的影响极大地影响融合率和融合后细胞的存活率。由图2C可知,融细胞密度是影响细胞融合的重要因素之一。PEG 浓度为合率随PEC的浓度增加而升高,PEG浓度为35%时融合率最50% .30C下融合反应20min,细胞密度在(2 - 20) x 10'个/ml高,因此,PEG的体积分数- -般在25% ~ 50%较适宜。图1细胞融合过程Fig. 1 The process of chicken red blood cells fusion25「B鼻8-信15￥86g 102↑下s052030353739细胞密度(x 10个/ml)融合温度(C)cell density( x 10cel/mL)fusion temperature(C)信30c30「I; 25画昌2:三215署号1010川員官s中国煤化工2535075MHCNMHG.PEC浓度(%)PEC concentratin(%)fusion time(min)日2 细胞密度(A)、融合温度(B)、EC浓度(C)、融合时间(D)对细胞融合率的影响Fig.2 Efets of cell densily (A). fusion temperature (B). PEC concentntion (C) and fusion time (D) on cell fusion rate2011年21(3)生物技术532.2.4融 合时间对融合率的影响高对细胞的毒性越大,且PEG浓度过高时细胞反应液体环境由图2D可知,在一定时间范围内融合率随反应时间增加粘滞度升高,可能会阻碍细胞融合。本研究细胞融合的PEG而增加,反应时间为40min时融合率最高达28. 36% ,而当反最适浓度为35% ,融合率为26. 78%.明显高于于李秀兰等12]1应时间延长为60min时细胞膜破裂较多,细胞形状发生改变，采用的最适浓度为50% PEG时融合率为20.72%。最适温度、故反应时间的适宜范围在30 ~ 50min。PEG浓度,细胞融合的最适融合时间为40min,结果与赵咏2.3正交试验梅']研究结果-致。笔者认为低浓度PEG延长融合时间,可在结合上述单因素实验的基础上,对影响细胞融合的各以取得较好的融合效果,且对细胞损伤较少。前人的报道1.8]因素,即融合温度、PEG浓度、融合时间,进行三因素三水平正只进行了单因素对鸡血细胞融合率的影响,本研究系统地进交实验。正交试验的结果(见表2)表明,三种考察因素对行了单因素实验及正交试验。通过正交试验极差分析确定鸡PEG诱导细胞融合效果影响程度不同,计算分析可以得出极红细胞融合的最佳条件组合为A2B2C2 ,即PEG浓度为35%、差(R)A>C> B,即PEG浓度对鸡红细胞的融合率影响较大，反应温度为35C下融合40min。在此条件下进行了3次平行其次为融合温度、反应时间。验证实验,细胞平均融合率为33.06%均高于文献7.8.12所报表2 1,33 正交试验及结果分析道融合率。在单因素实验结果中发现，细胞密度为2.0x 10°Tab.2 L3 Orthogonal test and result analyis个/ml时细胞融合率达最高,但升高到2.0x 10'个/ml时,就试验号B细胞融合率(%)因密度过高而无法计数,下一步我们将在A2B2C2条件下进行1(25%) 1(30min)1(33C)7.5最适细胞密度的探索。2( 40min)2(35C)11.59 .参考文献:3(50min)3(37C)9.2[1]Clas B. Johansson, Sawsan Youssef, Kassie Koleckar, et al. Extensive2(35%)24. 13fusion of haematopoietic cells with Purkinje neurons in response to chronic216.78infammation[J]. Nature Cell Biology, 2008 ,10:575 -583.322. 39[2]Zhi Hu, Shihui Liu, Xuancheng Mai, et al. Anti - tumor efects of fu-3(50% )7.0sion vaccine prepared by renal cell carcinoma 786 - 0 cell line and periph-14. 28eral blood dendritic cells of healthy volunteers in vitro and in human im-10.53mune reconstituted SCID mice[J]. Cellular Immunology, 2010, 262T8.29%8.63%44.17%(2);112-119.T263.3%42. 65%46.25%[3]Claire Robinsona and Andreas F Kolb. Analysis of mammary speiegene loeus regulation in diferentiated cells derived by somatic cell fusionT:31.81%42. 12%30. 98%[J]. Experimental Cell Research,2009 ,315(3): 508 -522.R35.01%4.02%I5. 27%[4]Anna Piliszck, Jacek A Molinski, Kazimiera Pyniak, et al. Foetal fi-注:TI、T2.T3分别为各因素不同水平含量之和,R为极差。broblasts introduced to cleaving mouse embryos contribute to full - lerm de-velopment[J]. Reproduction ,2007 ,33(1): 207 -218.3讨论[5]Elizabeth H. Chen and Eric N. Olson. Unveiling the mechanisms ofPEG对水有极高的亲和性,可与水分子借氢键结合,产生cell fusion[J]. Science ,2005 ,308: 369 - 373.渗透梯度导致细胞间或囊泡间的聚集。较高浓度时(40% ~[6]杨汉民细胞生物学实验[M].2版.北京:高等教育出版社,50% ,分子量为4000 ~8000),由PEG产生的高渗透压破坏1997:109 -110.互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层,使得细胞间的接触点[7]赵咏梅，郭云婷,马蕊，等.PEC介导细胞融合的最适条件探究质膜变得不稳定9”,随后形成-一个大的双核或多核融合细胞。[J].西安文理学院学报:自然科学版,2007, 10(3):7 -78.有文献报道以兔血细胞、鸽血细胞及小鼠血细胞([7.10]为材料，[8]赵彦禹,张艳华,冯照军.鸡红细胞融合最适条件得探讨[J].生物但这些材料成本高,且实验效果不佳。笔者也试用小鼠血细磁学,2006,6(1):43 -44.胞为材料,但由于细胞小且无核,使得判断融合与否非常困[9]SW Hui, TL Kuhl, YQ Guo, el al. Use of poly( ethylene glycol) t0o难。而鸡血红细胞体积较大且细胞核清晰,易于观察与统计control ell aggregation and fusion[ J]. Colloids and Surfaces B: Bioint-融合细胞。erfaces, 1999 ,14: 213 -222.细胞密度决定细胞间发生融合的有效距离,进而影响细[10]中国煤化工作细胞融合材料的可行性胞融合率。通过比较不同细胞密度对融合率影响，结果得出研究33(3): 244- 245.密度为2x 10*/ml为最适条件。同一时间下鸡血红细胞融合[1]HC N M H G胞融合条件的正交设计优的最适温度为37C ,膜的流动性随温度上升而加快,有利于细化[J].生物技术,2009,19( 6):44-45.胞融合的进行。但温度为39C时,细胞膜破裂，融合率降低，[12]李秀兰,姜日水.聚乙二醇诱导细胞融合影响因素探究[J].菏泽其结果与鲁云风等["的研究结果-致。PEG 的体积分数越学院学报.2007 ,29(5):79 -82..