速生杨二步超低酸水解液发酵制取燃料乙醇的研究

第27卷第4期林产化学与工业Val 27 No 42007年8月Chemistry and Industry of Forest ProductsAug.2007速生杨二步超低酸水解液发酵制取燃料乙醇的研究庄新妹',王树荣”,袁振宏’,骆仲泱2,吴创之,岑可法2(1.中国科学院广州能源研究所;中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室广东广州510640;2.淅江大学能源清洁利用国家重点实验室,浙江杭州310027)要;以速生杨二步超低酸水解方法获得的水解液为原料,在28℃、100v/min等发酵条件下选择热带假丝酵母(C2.637)和酿酒酵母(S2.699)分别对第一步和第二步水解液进行了发酵制ZHUANG Xin-shu取燃料乙醇的研究,并考查了Ca(oH)2中和、过申和、活性炭吸附等预处理方法及菌种预适应驯化对乙醇转化率的彩响。结果教明:热带假丝酵母能够更好地利用第一步水解液生成菌体,适合生产单细胞蛋白;菌种驯化后发酵速度和乙醇特化率均有提高,尤其是以酿酒酵母发酵第二步水解液,乙醇转化率由1445%增至39.37%;Ca(OH)2过中和的方法处理后的水解液,乙醇转化率有所增加;以五碳糖为主同时含有六碳糖的逮生杨第一步水解液,假丝酵母发酵产乙醇的效果好于酿酒酵母关犍词:速生杨;二步超低酸水解液;然料乙醇中图分类号:TQ91;TK6文獻标识码:A文章编号:0253-2417(2007)04-0061-05Study on Production of Fuel Ethanol from Poplar Hydrolyzate obtained byTwo-step Super-low Acid HydrolysisZHUANG Xin-shu, WANG Shu-rong, YUAN Zhen-hongLUO Zhong-yang, WU Chuang-zhi,CEN Ke-fa(1. Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Science: Key Laboratory of Renewable Energy and Gas Hydrate, CASGuangzhou 510640, China; 2. State Key Laboratory of Clean Energy Utilization, Zhejiang University, Hangzhou 310027, ChinAbstract: Choosing hydrolyzate of poplar as fermentation material, which was obtained by two-step super-low acids hydrolysisfuel ethanol production was studied by using Candida tropicalis 2. 637 and Saccharomyces cerevisiae 2, 699 respectively. Simultaneously the influences to the ethanol yield by various pretreatment methods, such as Ca( OH) neutralization, over-neutralizationactive carbon adsorption and yeast-training were carried out. The experimental results show that C. tropicalis 2. 637 is suitable tothe first-step hydrolyzate rich in pentose to produce single cell protein. Yeast-training can improve fermentation speed andethanol yield, especially to the second step hydrolyzate through which ethanol yield was increased from 14. 45 %to39. 37% by S. cerevisiae 2. 699. The over-neutralization of hydrolyzate by Ca(OHh improved ethanol yield, too. Therefore, forthe hydrolysis of the first-step hydrolyzate, which containg mainly pentose and accompanied with hexose, more ethanol can beobtained by C. tropicalis 2. 637 than by S. cerevisiae 2. 699Key words: poplar; two-step super-low acids hydrolysis; fuel ethanol以生物质为原料生产燃料乙醇有着广阔的市场前景,对解决日益紧迫的液体燃料短缺问题具有极其重要的意义。燃料乙醇的开发应用是当前减少石油消耗、降低城市环境污染最直接、最有效的方法,尤其是《京都议定书》的生效燃料乙醇的应用更被作为发达国家利用生物质能减排CO2的一项有效中国煤化工收稿日期:2006-04-14基金项目:中科院广州能源所所长基金人才引进专项(0607651);国家自然HCNMHG作者简介:庄新妹(1970-),女青林抚松人,副研究员博士,主要从事生物质制取高品位燃料的研究;E-malL: zhuangs@ ms giecac en通讯作者:王树荣,副教授博士,从事生物质能源化利用等研究;Ema: erwang@cree,可,cdhu,cn林产化学与工业第27卷措施(。目前中国、巴西美国、欧洲一些国家和印度泰国津巴布韦南非等国都已开始实施乙醇汽油计划。用汽油发动机的汽车,乙醇加入量为5%~22%;专用乙醇发动机汽车,乙醇加入量为85%-100%123。然而目前燃料乙醇大都来自粮食和糖类作物的发酵,从长远看来是没有前途的。作者尝试以速生杨二步超低酸水解液发酵制取燃料乙醇因速生杨是优良的速生林树种,为生物质制取燃料乙醇的大规模利用打下基础。1材料和方法1.1材料及仪器设备发酵样品:高温液态水解法得到的速生杨第一步水解液,以超低酸水解速生杨得到的第二步水解液,具体见文献[4]。发酵菌种热带假丝酵母( Candida tropicalis2.637),用于发酵第一步水解液的五碳糖酿酒酵母(S. cerevisiae2.399)用于发酵第二步水解液的六碳糖,皆购置于中科院微生物所。综合考虑前人的研究成果确定发酵温度为28℃水解液p值为5-55摇床转速为100rm1°仪器与设备:HZQ-Q振荡器;HPG400光照培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司制造;电子显微镜,上海兴行显微镜制造有限公司;手提式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;HITACH20PR-52D自动高速冷冻离心机;721分光光度计,上海第三分析仪器厂;超净工作台,哈尔滨市东联公司。1.2水解液预处理1.2.1预处理方法将第一步和第二步水解液分别以Ca(OH2中和至pH值5~6,然后用活性炭吸附脱毒处理(100mg/L,搅拌80min),用以脱色及减少乙酸糠醛、5-羟甲基-2-糠醛(HMF)等发酵抑制物的影响,过滤后以旋转蒸发仪进行真空浓缩使还原糖质量浓度达到50g/L左右。1.22过中和处理取部分速生杨第一步水解液,先以Ca(OHh调至pH值12.22,然后用1%H2PO反中和至pH值5~6,再活性炭吸附、真空浓缩。发酵液处理情况见表1。可见经过中和、活性炭吸附预处理后还原糖有一定程度的损失。样品浓缩时的泡沫主要来自于样品中的果胶类产物,可以看出,以高温热水法得到的第一步水解液中该产物含量较低,通过Ca(OH)2的过中和处理,也可以去除部分果胶衰1发酵液处理Table I Processing of fermenting liqu还原糖质量浓度/(g·L2)样品编号发酵菌种后p值附注t" g yeasts初始预处理后预处理后浓缩 pH value aflerAnnotationSpretreatment第一步水解液1c.2631353较易浓缩第一步水解液过中和处理易浓缩泡沫少neutralizing of8份11.1849.912.22 -5.5 easier to concentratefirst-step hydrolyzatsecond-step hydrolyzate m酿酒酵母24.8221.88第二步水解液难浓缩泡沫多hard to concentrate,more foam13培养基选择马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用于菌种的保存化培养H中国煤化工)进行酵母的驯CNMHG1.4菌种的驯化将购自中科院微生物所冷冻真空保存的热带假丝酵母和酿酒酵母用无菌水制成菌悬液,无菌操作第4期庄新姝,等:速生杨二步超低酸水解液发酵制取燃料乙醇的研究涂布PDA培养基,28℃恒温箱培养。3d后再用同样的培养基转接活化一次。将菌种接人YPD培养基中,培养基中水解液的比例随着驯化次数每次增加1/3,则到第三次驯化培养基就全部是水解液。其中每次驯化培养24h,离心分离菌体,接到下一步驯化液中,最后将第三次驯化的酵母接到以水解液和琼脂制备的固体培养基上,2d后接入种子液,以便保证接种到种子液菌体的活性。1.5种子液制备种子液的制备分4步进行:1)将3种水解液样品以4℃,12000/min离心10min,弃沉淀,取上清液。112℃灭菌30min,保存在灭菌后的三角瓶中;2)分别取3种水解液样品10mL,加入1%酵母粉,1%(NH4点2SO4,0.2%KH2PO4,0.1%MgO4·7H2O,作为种子液;3)无菌条件下以接种环将酿酒酵母接入种子液(Ⅱ)中,同样方法将热带假丝酵母接入种子液(I)和(IZ);4)置于28℃、100r/min恒温摇床上培养种子液菌体浓度在0个/mL以上时接入发酵液。1.6发酵取30m灭过菌的水解液于250mL锥形瓶中,向其中加人1%(NH4hSO4。种子液按10%体积接入,其中酿酒酵母25×10个/mL热带假丝酵母3.375×103个/mL。28℃,100r/min恒温摇床上培养,间隔12h取样1mL,离心后测乙醇浓度。1.7分析方法及计算公式荫体细胞浓度的测定采用血球板计数法。乙醇分析测试采用分光光度计法9。Y(EtoH) =c(EtoH)x100(n xp式中:Y(EOH)—乙醇转化率%;c(EOH)一乙醇质量浓度,gL;n计量系数酿酒酵母发酵葡萄糖n=0.51,假丝酵母发酵木糖,n=0.46;pm浓缩后还原糖质量浓度,50g/L。2结果分析2.1两种酵母菌的生长情况图1为热带假丝酵母(C.2637)和酿酒酵母(S.2.399):6分别在经过预处理的速生杨第一步水解液和第二步水解液中5的生长变化曲线,从图中可知二者呈现出不同的生长趋势,假画4丝酵母菌数增加较快,30h已达5.5×103个,30~36h长势3缓慢,酿酒酵母24~36h基本没有变化;二者36h后皆成快速2生长趋势。说明假丝酵母能够较好地利用第一步水解液中的时间h低聚木糖、木糖等生长菌体酿酒酵母对底物不是很适应,增--假丝酵母c2637;-△-酿酒酵母S.239长缓慢,总菌数不足假丝酵母的一半。故假丝酵母利用第图1两种酵母在水解液中的生长情况步水解液生产单细胞蛋白用于动物饲料,很有潜力。Fig. 1 Growths of two yeasts in hydrolyzate2.2菌种驯化对发酵制乙醇的影响将分别在第一步水解液和第二步水解液中驯化的热带假丝酵母和酿酒酵母分别用于发酵水解液图2(a)为以第一步水解液为基质驯化后的热带假丝酵母与未经驯化菌种发酵情况的对比。由图可知驯化后乙醇转化率最高点出现在24h,为16.34%,较未驯化发酵速度加快转化率略有提高。图2(b)为在速生杨第二步水解液中,驯化后的酿酒酵母与未驯化菌种的发酵情况对比,可见驯化后酿酒酵母发酵能力有很大提高最高乙醇转化率由14.45%升高到39.37%,24~48h都有较高得率。这说明经过驯化,这两种酵母对水解液的适应性增强,尤其是酿酒酵母能够较好地利用基质。因时间所限,没有进行最佳发酵条件的摸索故本研究得到的乙醇得率并非最隹中国煤化工2.3样品过中和处理的发酵情况以热带假丝酵母对速生杨第一步水解液进行发酵研究,夏,CNMHG内妞下后反中和再进行炭吸附处理的样品,发酵情况好于直接以Ca(OH)2中和至pH值5~6然后炭吸附。由图3可见,两种处理方式发酵规律基本一致,乙醇转化率最高点皆出现在36h,但过中和处理后的样品乙醇转化率提高64林产化学与工业第27卷约4个百分点。时间几时间hO一菌种驯化 acclimatised yeasl;-△-菌种未驯化or图2速生杨第一步水解液(a及第二步水解液(b)菌种驯化发酵情况对比Fig2 Comparison of fermentation properties of the first hydrolyzate(a)and the second hydrolysate( b)withthe original yeast and acclimatized yeast2.4菌种对速生杨第一步水解液发酵制取乙醇的影响从水解液的高效液相色谱(HPLC)分析可知第一步水解液主要成分为木糖等五碳糖,同时又含有葡萄糖,所以分别用两种菌种对其进行发酵研究(见图4)。发现酿酒酵母乙醇转化率低于假丝酵母。可能的原因是第一步水解产物中葡萄糖含量过低,再则热带假丝酵母发酵速度快于酿酒酵母,24h即出现乙醇转化率最高点,酿酒酵母乙醇转化率最高点出现在60h左右,这也说明了假丝酵母在相同基质中生长速度快于酿酒酵母。10020406080100020406080100时间时间h一过中和 over-neutralizing;-△-原液 original liquid一假丝酵母C2637;-△一酿酒酵母S2399图3第一步水解液过中和处理与水解原液发酵对比图4驯化后的两种酵母用于第一步水解液发酵对比Fig 3 Fermentation of over- neutralizing and originalFig. 4 Fermentation of the first hydrolyzate with twosample of the first-step hydrolyzatekinds of acclimatized yeast3结论3.1以Ca(OH)中和、过中和然后活性炭吸附等预处理方法选择热带假丝酵母(C2637)和酿酒酵母(S2.699),并对菌种进行了预适应驯化,在28℃、100m/min等的发酵条件下,对速生杨二步超低酸水解液分别进行了发酵制取乙醉的研究。从两种酵母菌生V中国煤化工多更好地利用第步水解液生成菌体适合生产单细胞蛋白。CNMHG32没有驯化的菌种表现出对水解液的不适应,乙醇转化既,醇迷度度;們拥化后对速生杨水解液发酵效果优于不驯化,尤其是以酿酒酵母发酵第二步水解液,乙醇转化率由14.45%提高到第4期庄新姝等速生杨二步超低酸水解液发酵制取燃料乙醇的研究39.37%,且发酵速度提高。33以Ca(OH)2过中和的方法处理后的水解液浓编时易起泡的果胶等物质减少,且乙醇转化率有所增加。3.4做为五碳糖和六碳糖混合物的速生杨第一步水解液,热带假丝酵母发酵产乙醇的效果好于酿酒酵母。参考文献:[1JIEA Biotechnology for the conversion of lignocelluloses to ethanol[r]. IEA Bioenergy Newsletter, 2000.[2 ]BADGER P C. EthanoL from cellulose: A general review [m]// JANICK J, WHIPKEY A. Trends in new crops and new uses. vA: AlexandriaASHS Pres, 2002.[3]刘军利蒋剑春论生物质能源标准体系(Ⅱ)—生物质燃料乙醇标准化研究进展[门]生物质化学工程,006,40(5):53-57[4]王树荣,庄新妹骆仲泱,等木质纤维素类生物质超低酸水解试验及产物分析研究[J]工程热物理学报,200,27(5):741-74.[S]LUO Cai-dian, BRINK D L, BLANCH H W. Identification of potential fermentation inhibitors in conversion of hybrid poplar hydrolyzate toethanol [ j]. 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