脂质分析进展

2002年第4期.粮食与油脂39文章编号: 1008-9578(2002)04- -039--03脂质分析进展Development in Lipids Analysis乔国平王兴国孙冀平胡学烟(江南大学食品学院， 无锡214036)摘要概述近年来脂质分析方法最新进展，简要介绍微波辅助提取法、超临界CO,提取法在脂质舍量测定方面的应用及原位脂肪酸甲酯合咸法在简化脂质分析中的应用。关键词脂质分析徵波法超临界CO, 法原位脂肪酸甲酯合威法中图分类号: TQ646文献标识码: A近年来,因脂肪酸营养特性和健康方面的影响,对脂肪可以对样品一溶剂混合物进行选择性加热,使得脂质在提取酸进行快速准确的分析就变得越来越重要。一般讲，脂肪总过程中受到不利条件的影响要比传统的加热方式要小。另量要用索氏(Soxhlet)抽提器测量，而脂肪酸主要是通过气外,微波技术也可应用于脂肪酸甲南的合成(4)和脂肪酸原位相色谱法(GC)来测定。因脂肪酸的沸点较高，进行色谱分衍生化[5),加速反应速度,提高反应效率。析时，要将脂肪酸转化成脂肪酸甲酯、异丙酯或丁南,而其中到现在为止,对微波辅助脂质提取虽然只有少量的研究又以脂肪酸甲嘴的沸点较低,在色谱图中所产生的峰形也较报告,但是对微波技术在分离有机化合物方面的广泛深入的突出,所以在分析生物体组织或食品中的脂肪含量和脂肪酸应用和其明显的效果正日益受到人们的关注,与之相关的微组成时经常进行的是脂肪酸的甲酯化。在进行脂肪酸甲酯波脂质提取设备也会不断在实践中得到应用。化时,为了避免干扰,常常要将脂质用有机溶剂从样品中提1.2超临界二氧化碳流体提取取出来,然后在催化剂作用下使脂质衍生化而生成胎肪酸甲利用有机溶剂提取法对各种含脂肪样品进行脂肪含量酯,再用GC法测定脂肪酸组成。整个过程时间长，且费用测定时，因为- 些脂寤性色素、蜡质和胶质也溶于非极性溶很商。此外,索氏脂肪测定法只能测定样品中的粗脂肪含剂而被同时提取出来，因此传统的索氏抽提法只能测定粗脂量,不能对脂肪含量进行准确定量。因此,许多研究工作者肪的含量,而不能够准确测定样品中脂肪的含量。而且,使-直在寻求一种快捷、简单的方法来代替传统的方法。近年用传统的方法测定脂肪时，还要消耗大量挥发性溶剂，会造来,出现了与这种需求相适应的几种新的提取方法和脂肪酸成环境污染并对操作人员的健康构成威胁,整个实验时间很测定方法，如徼波辅助提取法和超临界流体提取(SFE)法，长,消耗能量高。近来，有研究工作者已开始尝试使用越临以及脂肪酸原位(in situ)脂肪酸甲酯合成技术等。界流体提取技术进行脂质的定分析，可以避免使用有毒的1提取新技术有机帮剂，减少实验操作时间,提高效率。而在此之前,超临1.1微波辅助脂质提取界流体技术只用于大批量的脂质提取。在进行超临界流体近来已有关于微波技术用于脂质提取的报道。利用微萃取过程中使用最多的是超临界CO2。波技术可以发展-种快捷、安全、代价低的方法来进行各种有研究工作者已经将超临界流体提取与传统的方法进行生物质的脂肪含量测定，而且,所处理的样品还可以不受水比较。Frod(6)等对几种油料种子、 牛肉和几种焙烤食品中的分的干扰(u,这使样品的预处理变得更简单,也避免了脂质脂肪含量用超临界二氧化碳进行测定,每份样品重1克,操作在进行高温干燥时氧化和变质。压力9,000 psi,温度100C,流速2L/分钟,在稳定后萃取25最初关于利用微波技术对脂质提取进行可行性研究出现分钟。然后再将所得到的脂肪进行甲酯化,用GC法测定脂在二十世纪八+年代,Ganzier2)等用微波辅助对油料种籽、肪酸含量。最后对超临界流体直接所得脂肪质量、GC法换算食品饲料和土壤中的脂肪含量进行测定，在操作中,他们将的脂肪含量以及传统的方法所得结果进行比较，得到了满意一定量的溶剂和样品混合后,用微波对样品进行30秒辐射处的结论。Sot(]等人对几种油料种籽在1000psi压力理(在处理过程中避免溶剂拂騰) ,冷却后再进行处理，重复几80C下用超临界流体处理3.0~3.5克样品,将所得脂肪含量次。然后进行离心分离,上清液挥千溶剂，并将所得脂肪用气与索氏抽提法测定的脂肪含量进行比较,得到了满意的结果。相色谱柱检测脂肪酸组成，证明比传统方法的效率要高很多。Dionisl[8]等对奶粉、牛奶巧克力等含脂食品中脂质利用超临近来,随此项技术的不断发展，出现了-些使用少量溶剂进行界CO2进行萃取,回收率达到98.4%,并对所得脂肪进行脂微波辅助提取的设备。Lerayl3等 用此设备对生物组织中的肪酸组成分析，与传统的方法相比没有明显差别。对于超临各种脂质进行了定性和定量分析,并与传统的方法进行比较，界流体进行脂质萃取的研究还有相当多的报道(9.0],都对这种证明用此方法不但使用的溶剂量很少,所用时间短,而且所得新技术可行性进行大量k研究工作。脂质与传统的方法所得相比并没有区别。超临界流体进行脂质萃取时，为了得到满意的结果,应虽然用徼波处理样品时也会引起脂质的氧化和脂肪酸中国煤化工就是温度和压力,因为含量的变化,但在通常条件下这种变化是很小的,而且与传它YH另外,只使用超临界.统方法所引起的同样的变化要小得多。这主要是因为微波cd.C.N M H G份的提取有很好的效收稿日期: 2002-02-084(粮食与油脂2002年第4期果,但对于非极性脂质萃取效果很差。因此对于含有-定量果是对已提取出来的脂肪进行甲酯化,则不必考虑水的影响。非极性朋质的样品(如牛奶)就不大适用。为了提高非极性但采用原位法直接对样品进行脂质的酯交换，样品是不可能完脂质的回收率,可以在超临界流体中添加少量的甲醇、乙醇，全脱水的。在水份达到-定量时，甘三酯很容易从单一相中分甚至是水作为挟带剂。Monanil)等利用两步萃取法(超离出来，从而减缓反应，甚至中止反应继续下去。Austin[14)临界CO2.超临界CO2/乙醇混合流体)对大豆进行脂肪和等人对大豆粕等多种含油样品进行分析时，采用已烷作溶磷脂的分别提取,结果发现极性较强的磷脂选掸性地溶于超剂，碱性催化剂处理I0mg样品,80"C下加热10分钟完成临界CO2/乙醇混合流体中。此外,样品的粉碎程度和含水脂质的衍生化。样品中水份达到10%时,甲酯化几乎已经量也应考虑在内。不能发生，而在8%时影响不大。Franz1)用 酸性催化剂，超临界流体萃取技术可以在很多方面取代传统的脂肪含甲苯为溶剂对含脂肪10~50mg的食品样品进行原位酯交量测定方法,但还存在者操作设备昂贵对非脂质成份(例如换反应，加入100 mg水对实验结果影响不大。因此，在进水)的萃取,以及在某些情况下对脂肪提取不完全等缺点,因此行酯交换反应时，必须考虑到对实验结果有影响的各种因.对于操作时的条件还应该不断优化，以能得到满意的结果。素,而且溶剂的选择与催化剂的种类也有-定的关系。2原位(in situ)脂肪酸甲酯合成2.2 催化剂选择对于各种含油物质的脂肪酸组成分析,-般的方法是进行原位脂质衍生化所用的催化剂,与传统甲酯化反应先用有机溶剂将脂肪萃取出来,然后在催化剂作用下进行使用的相类似,包括重氮甲烷酸性催化剂(HCIHSO,脂肪酸的衍生化得到脂肪酸甲酯,最后用GC法测定脂肪BF;)和碱性催化剂NaOCH,NeOH和KOH)等。重氮甲酸组成和含量。这种传统的方法需要大量的溶剂，操作繁烷是一种高效、快速的酯交换催化剂,但因操作条件苛刻、使琐,所用时间很长，效率不高。因此,研究工作者一直在寻用寿命短而不被广泛采用。在实际操作中常使用的是酸或求一种简便、易行的方法进行脂质的分析,其中最有成效的碱性催化剂。就是脂肪酸甲南的原位(in siu)合成法。“原位” 合成法，2.2.1碱性催化剂是0uen[1]等人于1976 年提出来的，即不进行脂质的提碱基催化反应速度快，条件褴和,在室温下即可发生反取过程，而是直接对样品用少量的有机溶剂和催化剂处理应,对-些酸不稳定脂肪酸(如含有环丙烯、环氧基等基团，进行酯交换,所以又称为一步萃取- 酯交换法。对祥晶中以及含共轭不饱和键结构)尤其适用。但碱性催化剂也有其脂质的提取、酯交换同时进行,大大缩短了实验时间,减少缺点:游高脂肪酸不会或很少量参加酗化反应;酯化时会发了有机溶剂的用量,也因为操作过程少而减少了实验误差。生皂化反应等。原位法与一般的脂质分析过程需要3~s克相比，使用的样碱基催化反应使用的有机溶剂通常为正已烷、石油醚和品量也大大减少，只需要几十毫克[13]。因此利用原位法进二氧杂环已烷。而使用最多的碱性催化剂为甲醇钠的甲醇行脂肪酸和脂质分析,不但可以分析各种含脂物质,也可对溶液，其制法是将金属钠投入无水甲醇中即可得到。此试剂在TLC法分离脂质过程中从展开板上刮下的硅胶中所含可以存放几个月。Austin4 等使用甲醇钠和己烷对谷物和脂质进行分析。乳制品中脂质进行分析,结果与AOAC官方方法相符合。.对于脂质的衍生化，包括脂肪酸的甲酯化和甘三酯的酯Dennis[10]等也使用类似的溶剂对婴儿奶粉中的脂质进行原交换两个过程:位脂肪酸甲酯化,同样得到满意的结果。除了NaOCH,外,还有其它-些有机类碱性催化剂,如R'-C0-0H+ CH,-0H回p'-CO-0CH。+ HOH四甲基胍盐(TMG)和氢氧化四甲胺就是比较常用的试剂。R'- co-OR" +CH-OH"威0C*R'-CO-0CH.+R" OH此类有机碱催化剂不但可以进行甘三南的雕交换甲酯化反应,也可以同游离脂肪酸发生反应，弥补了NaOCH,不足。脂肪酸只能在酸性催化剂和重氨甲烷作用下进行酯化Schuchard(1]等人使用TMG对游离脂肪酸含f达6.7%的反应，而甘三酯则可在酸性、碱性和重氮甲烷作用下进行酯脱胶油进行甲酯化,其甲雕化程度可以达到99%。马亭[18)交换。对于天然存在的生物物质中的脂质,脂肪酸-般以甘等人用氢氧化四甲胺1甲醇作为继化剂和反应试剂分析鱼三酯或磷脂的形式存在，因此对于脂肪酸甲甯的合成主要指油中的脂肪酸组成,并使游高脂肪酿转化为氢氧化四甲胺的的是酯交换过程。脂肪酸盐,后者在气相色谱的进样室内受热裂解而生成相应在进行“原位”脂肪酸甲酯合成时需要注意两点:脂质的脂肪酸甲酯,经处理后的样品直接用于GC/MS和GC分的痦解性(应该溶解迅速、反应完全)和防止水和其它化合物析,得到满意结果。的干扰。因此， 必须根据样品的性质决定使用何种落剂,是2.2.2酸性催化剂否要进行干燥，以及选择何种催化剂等。因为酸性催化剂可以将注射脂肪酸和结合脂肪酸同时2.1溶剂选择进行催化而得到广泛应用，但是与碱性催化剂相比，反应时进行原位脂肪酸甲酯的合成,需要选用合适的溶剂，此溶需要加热(50~100C),且反应时间长(1~2小时)。另外, .剂对脂质(特别是不易溶于甲氧基催化剂中的非极性脂质)有中国煤化工图中月桂酸甲酯后会很好的溶解性，使甲醇、脂质和其它试剂形成完全互溶的状出现YHCNMHG; NMR确定此蜂为r-态。如果样品中存在-定量的水份,必须考虑水的影响。如2002年第4期粮食与油脂41HOCH2 ,0.H'MeOH,CH;HzCγ-戊酮酸甲酯峰的出现会使测定值偏高，但在高脂肪、lyical Supereitial Fluid Extraction [U]. J. AOCS, 1993, 70低糖分样品中影响较小。(4): 437-439.酸性催化反应使用的溶剂有已烷四氢呋喃、苯甲苯和[8] F. Dionisl el. Supercritical CO, Extracion for Total Fat Ana-氟仿等(2),其中效果最好的是苯,但因为苯有毒,所以一般倾，lysis of Food Products [印J. Food Sci. 999 64(4); 612--615.向于使用甲苯。常用的酸性偿化剂为HCI.H2SO.,BF, 的甲[9] Peter et. Comparison of Supercritical Carbon Dioxide and醇溶液。由于酸性倦化反应使用的溶剂、催化剂种类、反应条Soxhlet Extraction of Lipids from a Browm Scaweed, Sar-件(温度、加热时间)等各不相同,得到的结果也不尽相同。gassaon hemipyllum (Turn.) C. Ag J. Agr. Food Chem.Fran{[5]用HC1- CH2OH 作催化剂,以甲苯取代苯作溶剂，1998, 46: 4228- -4232.分析食品中所含脂质时,所得结果与传统的酸解- -乙醚萃取[10] s. P. J. Brooks et. Measuring Total Lipid Conent in Rat方法相比偏高,但比氯仿-甲醇提取法所得结果要低。KeCarcasses: A Comparison of CommonlyEmployed Extract-vinf[1]等用H:SO.- -CH2OH 对葵花籽进行原位甲南化,在甲ion Methods []. J. Agr. Food Chem. 1998, 46. 4214- -4217.醇佛点温度下反应4小时，所得结果要比己烷提取法为高。(11] Luigi Moitanari et. Selecive Extraction of Phospholipid使用原位法进行脂质的酯交换,只要选择合适的催化Mixtures by Ssupereritical Carben Dioxide and Cosolvents剂，反应条件恰当(含水量、温度、样品量、使用的非极性溶[小. J. Food Sci. 1996, 61(6); 1230-1233.剂),理论上得到的定性与定量结果与传统的方法相比不会(12] Outen t. Diret Methylation of Long Chain Fatty Acids in有明显的差别。而且由于原位合成脂肪酸甲酯操作过程简Feeds, Digesta and Fecs Without Prior Extration ([], J.单，在反应过程中也没有加入不利的实验操作，实验误差就Sci. Food Agr. 1976, 27: 419-425.要小得多,所得结果应该比传统的方法更准确。实际上由于[13) M. Sonichsen, B. w. Mulr. A Rapid and Quantitarive祥品中往往含有一定的水分,或是有些脂质与样品结合的Method for Total Fatty Acid Analysis of Fungi and Other比较牢固而不能完全反应,为了得到准确、可信的结果,需要Biological Samples [0 Lipids. 199, 34(12): 1347-1349.对样品进行预处理。但总的来说,脂质的原位合成法对大多[4] Austin R Long, Rapid Direcl Extraction Derivatizaton Mc数样品来说都是可行的。thod for the Detcrmination of Acylgycerol Lipids in Selected参考文献Sarmple Matrices []. J. Food Sai. 1988, 53(3): 940- 942.[1] J. R. Jocelyn Pare et. Use of the Microwave Assisted Pro-[15] Franz Ulberh, Monika Henninger. One Step Extraction/cess in Extration of Fal from Meat, Dairy, and Egg Pro-Methylation Method for Determining the Fatty Acid Compo-ducts under Atmospherie Pressure [J]. J. AOAC, 1997, 80sition of Procesed Foods [u]. J. AoCS. 1992, 69(2): 174 -177.(4): 928- -933.[16] Dennis et. Delerminationof Lipids in Infant Formula Po-[2] Katalin Ganzler et. Microwave Extraction. A Novel Samplewder by Direct Extraction Methylation of Lipids and FattyPreparation Method for Chromatography [J]. J. Chromato-acid Methyl Esters (FAME) Analysis by Fas Chromatogra.gr. 1986, 371: 299-306.by [. J. AOAC.199: 82(5): 1128-1139.(3] Leray et. Microwave Oven Extraction Procedure for Lipid[17] Schuchard et. Tetramethylguanidine Catalyzod Trasesterifca-Analysis in Biological Samples [凹] Analyis 1995, 23: 65- 67.tion of Fats and Oils:A New Method for Rapid Determination[4] Rodriguez t Enrichment of Saturated Fatty Acid Contai-of Their Compostion [0 J. AOCS.1988, 65: 1960--1941.ning Phospholipids in Sheep Brain Serolonin Roceplor Pte-[18]马亭.深海鱼油中脂肪酸的分析UJ]分析化学研究简报，1999paration: Use of Microwave Irradiation for Rapid Trangcs-27 (4):415- -418.terification of Phospholipids D]. Biochim. Biophys. 1992，,[19] Frod J. Elr. lbierference by Mecthy1 Levulinate In Deter-110: 65- -74.mination of Total Fat in Low Fat, High -Sugar Products[s] I. Rodrigucz C. Speciation of Organotin Compounds inby Gas Chromatographic Fatty Acid Methyl Ester (GC-Marine Biomaterials after Basic Leaching in a Non-focusedFAME) Analysis []. J. AOAC. 1999, 82 (3): 766 -769.microwave Extractor Equipped with Pressurized Vessels [U].[20] Pritam ct. Rapid Mthod for Determination of Total FattyJ. Chromatogra. 1997, 774: 379- -387.Acid Conlent and Composition of Feed stufts and Feces [U]L[6] Fred J. Eller, Jerry W. King, Supertical CO, ExtractionJ. Agr. Food Chem.1988, 36: 1202- -1206.of Fat: Comparison of Gravimetrie and GC-FAME Mc中国煤化工-ntional and n situ Mothods [u. J. Agric. Food Chem. 1998, 46: 3657- -3661.d Oil from 8 Series of[7] Scoll el. Determination of Oil Content in Oilseeds by Ana-C N M H G8s, 62 (:100 -1013.