乙醇浓度对人参多糖分离的影响

第41卷第2期东北师大学报(自然科学版Vol, 41 No. 22009年6月Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition)June 2009[文章编号]10001832(2009)020154-06乙醇浓度对人参多糖分离的影响朱梅',毕宏涛2,杨威2,刘杨2,台桂花2,周义发(1.北华大学化学与生物学院,吉林吉林132013;2.东北师范大学生命科学学院,吉林长春130024)[摘要]研究了不同浓度的乙醇对人参多糖分离的影响.结果表明,乙醇浓度在很大程度上影响着人参多糖的分离效果和产率,通过对不同浓度乙醇提取和沉淀的多糖组成和相对分子质量的分析,得出了分离人参多糖的简便方法:依次用体积分数为70%,50%,30%的乙醇和蒸馏水提取,经大孔树脂和透析分离,可分别得到皂甙、单寡糖、中性多糖和酸性多糖;人参水提取液经40%,60%,70%的乙醇分步醇沉,可分别得到不同相对分子质量的多糖和单寡糖,[关键词]人参多糖;索氏提取法;乙醇分级;人参寡糖[中图分类号]Q538[学科代码]180·1720[文献标识码]A人参( Panax ginseng C.A. Meyer)是五加科( Araliaceae)人参属植物,其根为名贵中药,在我国和亚洲有着数千年的药用历史.人参具有多种药理功能,其活性成分为人参皂苷、多糖、多肽和少量的小分子物质.人参多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等药理活性(210,近些年来随着糖生物学研究的迅速发展,人参多糖也越来越多地引起了人们的关注,大量的研究表明,人参多糖的相对分子质量和组成与活性有着密切的关系15.通常水提取的人参多糖往往含有人参单寡糖和人参皂甙,需要经过复杂的分离纯化过程才能得到人参多糖纯品,影响人参多糖的研究和应用.本文探讨了利用不同浓度的乙醇提取人参多糖和沉淀人参多糖的过程,并对所得人参多糖的产率和组成进行了研究,以期优化一种简便易行的分离人参多糖的方法1实验部分1.1材料、试剂与仪器实验所用干燥人参根购于吉林省抚松县人参种植基地,经粉碎后用于人参多糖的提取.单糖、二糖及三糖标准品均为 Sigma-Aldrich公司产品, Sephadex G-75凝胶为 Pharmacia公司产品,D101型非极性大孔树脂(净品级)为天津海光试剂有限公司产品,其余均为国产分析纯试剂验仪器: Shimadzu10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津);723型分光光度计(上海精科);FD1A冷冻干燥机(北京博医康);z36-HK高速冷冻离心机(德国 Herrle)1.2实验方法1.2.1不同浓度乙醇提取分级人参多糖1.2.1.1人参多糖的提取将50g人参干粉装入索式提取器中,加入300mL99.7%(体积分数)的乙醇80℃条件下进行索式提取,每隔1h用薄层层析法(TLC)检测虹吸回流的液滴,待硅胶板上各点的颜色基本消失时,停止加热;冷却至室温后离心将提取液和残渣分离提取液旋转蒸依次用90%,80%,70%,60%,50%,30%的乙醇溶液和蒸H中国煤化工按照上述操作CNMHG[收稿日期]2009-01-23[基金项目]国家自然科学基金资助项H(30770489);吉林省科技发展计划项目(20070710)[作者简介]朱梅(1963-),女,副教授,主要从事药用植物资源研究;周义发(1962-),男博士,教授,博士研究生导师,主要从事多糖的结构与功能研究第2期朱梅,等:乙醇浓度对人参多糖分离的影响l551.2.1.2人参多糖的分离采用D101型非极性大孔树脂对提取液中的皂甙和糖类化合物进行分离,样品依次用蒸馏水和梯度乙醇溶液洗脱,TLC跟踪检测1.2.1.3TLC检测人参多糖、单寡糖及皂甙采用硅胶G薄层层析板(厚约0.25mm);展层剂为氯仿与甲醇的混合溶液(v(氯仿):V(甲醇):v(水)=65:35:10);显色剂为5%硫酸乙醇溶液在此检测条件下,人参多糖由于极性大而位于原点处且为黄色斑点;人参皂甙和人参单寡糖由于极性相对较小而随展层剂展开,人参皂甙为粉红色斑点,人参单寡糖为黄棕色斑点斑点颜色的深浅与物质的含量直接相关,颜色越深含量就越高,因此可以用TLC估算出产物中人参多糖、人参皂甙和人参单寡糖的相对含量1.2.2不同浓度乙醇沉淀分级人参多糖将500g人参干粉用蒸馏水进行索氏提取,提取液浓缩至2L后,等分成4份备用1.2.2.1分别醇沉取3份浓缩液缓慢加入96%的乙醇,使乙醇的体积分数分别达到70%,75%和80%;静置过夜,离心,得到的上清和沉淀分别记作:GRS1和GRP1;GRS2和GRP2;GRS3和GRP3,沉淀常规干燥,上清旋转蒸发除去乙醇后冷冻干燥.1.2.2.2分步醇沉取1份浓缩液,缓慢加入96%的乙醇,使乙醇的体积分数达到40%静置过夜,离心,沉淀(GRPa)常规干燥;向上清继续加入96%乙醇,使乙醇的体积分数达到60%,静置过夜,离心,沉淀(GRPb)常规干燥;再向上清中加入96%乙醇,使乙醇的体积分数达到70%静置过夜,离心,沉淀(GRPc)常规干燥,上清(GRS’)旋转蒸发除去乙醇后冷冻干燥1.2.3相对分子质量分布检测采用 Sephadex G75(2cm×100cm)凝胶色谱柱检测所得产物相对分子质量的分布,洗脱液为0.15mol/ L Nacl,洗脱速率0.15mL/min,苯酚-硫酸法连续检测.1.2.4单糖组成分析1.2.4.1样品的甲醇解及酸水解称取2mg样品,加入1mL2mol/L的无水盐酸甲醇,充氮气封管,80℃水解16h;氮气吹干后,再加入1mL2mol/L三氟乙酸,120C水解1h,水解产物转入蒸发皿中,加入适量无水乙醇除去三氟乙酸,水浴蒸干1.2.4.2单糖衍生物的制备衍生化过程参照文献[16]的方法稍作改进:向样品水解产物中加入0.5mL1-苯基3-甲基5-吡唑啉酮(PMP)试剂和0.5mL0.3mol/ L NaOH溶液,70℃反应30min,盐酸中和,氯仿萃取过量的PMP试剂后,对所得的单糖PMP衍生物进行HPLC分析.1.2.4.3高效液相色谱分析采用 Shimadzu10ATvp高效液相色谱系统进行色谱分析,检测波长245nm,色谱柱 DIKMA Inertsil ODs3(5pm,150mm×4.6mm),柱温35℃,流速1.0mL/min,流动相:18.7%乙腈+81.3%磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH=7.0)2结果与分析2.1不同浓度乙醇提取人参多糖2.1.1第一次索氏提取中国煤化工为了进行提取条件的初步筛选,分析人参中皂甙、单寡糖HCNMHG取时的分布情况第一次索氏提取采用了99.7%90%,80%,70%,60%,50%,30%的乙醇溶液和蒸馏水8个浓度梯度.提取结果见表1,其中提取时间为TLC检测不到提取物的时间.由表1可见80%的乙醇所需的提156东北师大学报(自然科学版)第41卷取时间最短,80%以下浓度的乙醇所需提取时间明显增长,说明人参中皂甙比多糖更易于提取由于最初的乙醇浓度较高提取物多数是易溶于醇的皂甙随着水的增多,寡糖逐渐被提取出来,水到达70%时,只有多糖被提取来这样,大部分人参皂甙被90%的乙醇提取出来,其余皂甙存在于乙醇体积分数≥70%的提取物中,单寡糖存在于90%~50%的乙醇提取物中,多糖存在于乙醇体积分数≤60%的提取物中,其中30%乙醇和蒸馏水的提取物中只有多糖,多糖提取量最大表1第一次索式提取的结果实验项目乙醉提取液体积分数/%提取时间/h甙单寡糖单寡糖多糖(含量从多到少排列)皂甙单寡糖单寡糖单寡糖提取物质量/g1.520.93产率/%3.04由此可知,70%的乙醇可以将绝大部分人参皂表2第二次索式提取的结果甙提取出来,50%的乙醇可以将剩余的人参单寡糖乙醇提取液体积分数/%实验项目提取出来,30%的乙醇和蒸馏水提取的基本是不掺70提取时间/h杂皂甙和单寡糖的人参多糖提取温度/C802.1.2第二次索氏提取提取物质量/g4.93(皂试)0.18(多糖)1.103.78根据第一次索氏提取的结果,第二次索氏提取9.05(寡糖)0.75(单寡糖)(多糖)(多糖)只采用了4个浓度梯度,即70%,50%,30%的乙醇产率/%9.86(8试)0.36(多糖)2.207.5618.10(寡糖)1.50(单寡糖)(多糖)(多糖)和蒸馏水.70%乙醇提取后,用大孔树脂分离提取物中的皂甙和单寡糖;50%乙醇提取后,透析分离提取液中的单寡糖和多糖.分析结果见表2.33789789112023511522303mina单糖标准品;b.经70%乙醇提取,大孔树脂分离所得的人参单寡糖;c.50%乙醇提取的人参多糖;d30%乙醇提取的人参多糖e.蒸馏水提取的人参多糖.1.PMP;2.甘露糖;3.鼠李糖;4.葡萄糖醛酸;5.半乳糖醛酸;6.葡萄糖:7.半乳糖:8.木糖;9.阿拉伯糖图1第二次索氏提取各产物单糖组成色谱图单糖组成分析结果(见图1)显示:70%乙醇提取经大孔组的单审施十西含有97%的葡萄糖;50%乙醇提取,经透析分离所得的多糖由葡萄糖(83中国煤化工(3%)组成,含有痕量的甘露糖和鼠李糖;30%乙醇提取的多糖由葡萄糖CNMHG糖(23%和半乳糖醛酸(8%)组成;蒸馏水提取的多糖由半乳糖醛酸(43%)、葡萄糖(34%)和半乳糖(9%)组成,含有少量的阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖.第2期朱梅,等:乙醇浓度对人参多糖分离的彩响157由图1可见,人参多糖的单糖组成与乙醇提取液的体积分数有很大的关系随着乙醇体积分数的降低,葡萄糖的含量逐渐减小,半乳糖醛酸含量逐渐增大,尤其是蒸馏水提取的多糖中半乳糖醛酸含量超过了葡萄糖由此可知,70%乙醇提取经大孔树脂分离得到由葡萄糖组成的人参单寡糖和人参皂甙,50%乙醇提取经透析分离得到人参中性多糖,30%乙醇提取得到含少量半乳糖醛酸的人参酸性多糖蒸馏水提取得到含大量半乳糖醛酸的人参酸性多糖3.2不同乙醇浓度沉淀分级人参多糖3.2.1分别醇沉将人参根粉碎后用蒸馏水提取,等量的提取液表3平行醇沉的实验结果分别用70%75%和80%的乙醇沉淀分级,结果见醇沉体积分数/%表3.由表3可见,沉淀的量随乙醇体积分数的增大上清/g41.9(GRs1)40.3GRs2)39(GRs3)而增大,而醇沉上清的量则是随乙醇体积分数的增沉淀/g22(GRP1)23.8(GRP2)25(RP3)大而减小.63.9GR-S-IGR-P.l901201501030609001501802103.0GRGR-P-30.0150180210GR-S-3GR-P-33.0000中国煤化工y/ mlCNMHG图2 Sephadex G75分析平行醇沉产物色谱图158东北师大学报(自然科学版)第41卷用分离范围在相对分子质量为1000~50000的 Sephadex G75凝胶柱层析分析醇沉分级产物,通过苯酚硫酸法检测以洗脱体积为横坐标,490nm处的吸光值为纵坐标作图,结果见图2如图2所示,醇沉上清均由相对分子质量≤1000的单寡糖组成醇沉沉淀均由多糖和单寡糖组成且沉淀中单寡糖的比例随着乙醇体积分数的增加而增大结果表明,70%乙醇可以将水提物中的多糖完全沉淀下来,但在所选的浓度范围内一次醇沉不能将单寡糖和多糖彻底分开.3.2.2分步醇沉将人参干粉用蒸馏水提取提取液依次用40%,60%和70%的乙醇沉淀分级,所得的沉淀和上清利用 Sephadex C-75进行分析,通过苯酚硫酸法检测,以洗脱体积为横坐标.,490nm处的吸光值为纵坐标作图,结果见图3GR-P-cGR→P-a0.2图3 Sephadex-75分析分步醇沉产物色谱图如图3所示,当溶液醇体积分数为40%时,沉淀中只含有多糖,且多糖的相对分子质量≥50000;醇浓度增加至60%时,在总体积与外水体积之间有明显的宽峰呈现,说明相对分子质量<50000的多糖也被沉淀下来,其与相对分子质量为50000以上的多糖含量比约为2:1,总体积处仍没有洗脱峰出现,说明无单寡糖被沉淀下来;当溶液的醇浓度达到70%时,沉淀中糖类物质的相对分子质量分布最为复杂,有大量的多糖和单寡糖同时存在,含量比约为1(相对分子质量≥50000)(1000<相对分子质量<50000:3(单寡糖),上清中只存在人参寡糖3结论本文采用不同体积分数的乙醇对人参多糖进行了提取和沉淀分离.结果表明,乙醇体积分数很大程度上影响着提取和沉淀分级产物的组成、相对分子质量和产同的A参多堤供了可以参考的方法中国煤化工根据乙醇浓度对人参皂甙、人参单寡糖和不同单糖组CNMHG,依次用70%50%,30%的乙醇和蒸馏水提取,通过大孔树脂和透析将人参皂甙、人参单寡糖和人参多糖分离同时将人参多糖分为中性多糖、含少量半乳糖醛酸的酸性多糖和含大量半乳糖醛酸的酸性多糖.第2期朱梅,等:乙醇浓度对人参多糖分离的影响159根据乙醇体积分数对人参寡糖和不同相对分子质量的人参多糖溶解度的影响,用40%,60%,70%的乙醇分步醇沉可以分别得到单寡糖、相对分子质量>1000的多糖和相对分子质量≥50000的多糖[参考文献][1]陈萍权宜淑.人参与西洋参研究进展「].基层中药杂志,2000,14(1):59[2]张彬林瑞超冯芳.人参多糖的研究概况「J].中国药事,2004,18(9):566-569[3]刘国臣,李盛钰,何大俊,等.甾体皂苷的选择性酸水解研究[门]东北师大学报:自然科学版,200739(2):87-91[4]任莉莉魏影非,杜惠兰,人参抗肿瘤作用研究进展[门].中成药2005,27(8):947-950.[5]傅平平,王维盅,高其品.人参根多糖化学性质及抗肿瘤活性的研究[].白求恩医科大学学报199420(5):439-441[6] XIAO BO SUN, TSUKASA MATSUM(TO, HIROAKI KIYOHARA, et al. Cytoprotective activity of pectic polysaccharidesfrom the root of Panar ginseng[J] Journal of Ethnopharmacology, 1991, 31(1):101-107.[7]台桂花张翼伸,梁忠岩.人参茎中水溶性多糖的研究[J.生物化学与生物物理学报,1988,20(2):119-122[8]赵俊.人参多糖的化学与药理学研究进展[J].国外医学中医中药分册,2004,26(2):79-81.[9]杨明崔志勇,王岩.人参多糖降血糖和肝糖原作用的研究[门中药药理与临床,1991,7(5):2224[10]杨明,崔志勇,王岩人参多糖对动物正常血糖及各种实验性高血糖的影响[门]中国中药杂志,1992.17(8):50050[11 SUN XIAO-BO, TSUKASA MATSUMOTO, HIROAKI KIYOHARA et al. Cytoprotective activity of pectic polysaccharidesfrom the root of Panar ginseng[]. J Ethnopharmacology, 1991, 31:101.[12] MASASHI TOMODA. KEIKO HIRAABAY ASHI NORIKO SHIMIZU, et al. Characterisation of two novel polysaccharideshaving immunological activities from the root of Panar ginseng [J]. Biol Pharm Bull, 1993, 16(11): 1087-1091.[13]傅平平,干维盅,高其品等人参根多糖化学性质及抗肿瘤活性的研究[J]白求恩医科大学学报,1994,20(5):439-441[14] Y(SHIKO SOMODA, TADASHI KASAHARA. NAOFUMI MUKAIDA, et al. Stimulation of interleukin-8 production bygiseng [] Immunopharmacology, 1998.38: 287-290.[15] JI-HYE LEE KYUNG HYUN KIM. Pectinlike acidic polysaccharides from Panar ginseng with selective antiadhesive activty against pathogenic bacteria [J]. Carbohydrate Research, 2006,34111154-1163.[16] SUSUMU HONDA. EIKO AKAO. SHIGE( SUZUKI, et al. High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet-absorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone derivatives [J].Analytical Biochemistry, 1989, 180: 351-357.The effects of ethanol concentrations on isolation of ginseng polysaccharidesZHU Mei, BI Hong-tao2, YANG Wei?, LIU Yang TAl Gui-hua, ZHOU Yi-fa21. College of Chemistry and Biology, Beihua University, Jilin 132013, Chinat2. School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024. China)Abstract: This paper reports the effects of ethanol concentrations on ginseng polysaccharide fractionation. The results show that the isolation and precipitation of ginseng polysaccharides were influencedby different ethanol concentrations. The produced polysaccharides were different among their molecular weight, composition by different ethanol concentration. In addition, the yields and isolation timewere different, too. Base on the results, a procedure for the isolation of ginseng polysaccharides was setup. Ginseng roots can be extracted sequentially by 70%, 50%, 30% and 0 of ethanol to give ginsenasides, oligosaccharide (including monosaccharide), neutral polysaccharides, acidic polysaccharides, respectively. In contrast, a series of polysaccharides with different molecular weight and oligosaccharides(including monosaccharides) were obtained by stepwise adding ethanol.Keywords: ginseng polysaccharide Soxhlet extractionsethaneYH中国煤化工saccharideCNMH编辑:方林)