大血藤RAPD条件的优化

浙江林学院学报2003,20(2): 141~ 145Journal of Zhejiang Forestry College文章编号: 1000-5692( 2003 )02-0141-05大血藤RAPD条件的优化金则新|,李钧敏1,钟章成2(1.台州学院生物系,浙江临海317000;2.西南师范大学生命科学学院,重庆北碚400715)摘要:在进行大血藤遗传多样分析时,首先要建立大血藤RAPD反应优化体系,有必要就反应条件进行探索。以改进SDS法抽提藤本药用植物大血藤叶片总DNA,进行随机扩增多态DNA( RAPD)分析,分别测试了镁离子、dNTP、 模板DNA含量、引物浓度、DNA 聚合酶量和牛血清白蛋白浓度对反应结果的影响。通过各因子的组合研究,得出大血藤RAPD分析较适宜的扩增条件是: 15 pμL PCR反应体积，1 x Taq酶配套缓冲液( 10 mmot L-1 Tris HCI pH9.0, 50 mmol L-1 KCl , 0.1%Triton X-100，1.5 mmol L-1 MgCl); 25.01x 10-9mol s-1 Taq酶(上海华美公司); 10 ng模板DNA; 15 pmol引物(上海Sangon公司); 2g L-1 BSA; dATP ,dCTP , dGTP和dTTP各0.15 mmot L-'。图4表2参8关键词:大血藤; RAPD;化学成分;药用植物中图分类号: Q946文献标识码: A大血藤Sargenodoxa cuneata 隶属大血藤科Sargentodoxaceae大血藤属。大血藤科为我国所特有1。大血藤为落叶木质藤木,长达10 m,根和藤可入药,有强筋骨、活血散瘀、止痛和通经之效,并可治疗阑尾炎和风湿性关节炎等,又可用作杀虫剂2]。国内外对大血藤的研究较少,仅对大血藤的次生代谢产物如三萜类皂素3]木质素4]和黄酮5]等进行了研究。为探索大血藤种群的遗传变异,从分子水平阐明植物变异与环境的关系。随机扩增多态DNA ( random amplifed polymorphie DNA , RAPD)是运用随机引物扩增寻找多态性DAN片段,用以作为分子标记的-种分子生物学研究手段,具有快速简便等优点6。利用RAPD技术对大血藤种群进行遗传多样性分析时,首先要建立稳定的反应体系,有助于RAPD结果的可靠性与重复性。为此,我们就大血藤RAPD反应中的dNTP浓度、镁离子浓度、Taq酶用量、模板DNA浓度、引物浓度和牛血清白蛋白( bovine serum albumin , BSA )等因素对实验结果的影响进行了实验,建立了重复性强,稳定的大血藤RAPD反应参数,为进-步分析大血藤遗传多样性提供了基础资料。1材料与方法1.1 模板DNA的制备与定量将采自浙江省临海市云峰的大血藤嫩叶,用湿布包裹,塑料袋封装,立即带回实验室,洗净后晾干,冻于- 70C超低温冰箱中,备用。大血藤DNA抽提根据刘康德等7]方法进行改进,取_ 70 °C冻存叶片研磨成粉状，取0.1 g转入1.5 mL离心管中,加入500 pμL提取缓冲液[ 100 mmohYH中中国煤化工, 3%可溶性PVP, 20mmot L-'β-巯基乙醇, 20 mmot L-1 EDTA ( pH8.0)],CNMHG,弃上清,取沉淀加入收稿日期: 2002-08-02 ;修回日期: 2003-01-13基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870160)作者简介:金则新(1960-),男,浙江临海人,教授,硕土,从事植物生态学等研究。142浙江林学院学报2003年6月500山裂解缓冲液[ 100 mmot L-1 Tris HCl (pH 8.0), 20 mmot L-1 EDTA ( pH8.0), 500 mmot L- 1NaCl , 1.5%SDS], 65 C水浴30 min ,不时轻轻颠倒,取出加入500 μL氯仿/异戊醇(24:1),颠倒成乳浊状, 10000↑min- I离心10 min ,取.上清加入体积分数为0.25乙醇和体积分数为0.11的5 mmolL-1 KAc( pH4.8),立即10000r min-|离心10 min ,取上清加入体积分数0.6异丙醇,置-20 C冰箱30 min, 12 000r min- 1离心10 min ,取沉淀,溶于30pL TE(含RNase5mg L-1)备用。DNA定量采用紫外分光光度计(日本岛津UV-2401 PC紫外可见分光光度计)与琼脂糖凝胶电泳双重定量。紫外分光光度法以ADNA为标准品，以A260对DNA进行定量;电泳图谱经UTHSCSAImageToo软件分析荧光面积，与标准DNA分子量参照物比较定量而得。1.2 RAPD反应程序表1 Mg2+ 与dNTP浓度组合本实验所用的PCR仪为上海高机公司生产的Table 1 Different treatment of Mg2 + and dNTP concentrationSRX-481 PCR仪。经过摸索,得适合大血藤RAPD分管号dNTP浓度/ ( mmod L-1)Mg2+浓度/ ( mmot L-1) .析的PCR反应程序(用6 C循环水冷却); 94 C预变0.101.性5min, 94 C变性1 min, 40 C退火1 min, 72 C延1.8伸2min,共35个循环,72C最后延伸5mino，2.11.3大血藤RAPD实验中各影响因素2.40.151.51.3.1 Mg2+与dNTP浓度对RAPD扩增的影响15pu山PCR反应液中含1x Taq酶缓冲液, 16.67x 10-97mol s-1 Taq酶(上海华美公司), 10 ng模板DNA，820 pmol引物(上海Sangon 公司),2g L-1牛血清90.20白蛋白。Mg2+与dNTP浓度见表1 ,加水补足体积至15 pu山,覆盖石蜡油按方法1.2进行PCR。1.3.2 其余因素对RAPD扩增的影响 模板DNA .量、引物用量、Taq酶量和BSA浓度如表2所示，各管加水补足体积至15 μl。覆盖石蜡油按方法1.2表2供试因子浓度用量Table 2 Volume of each factor concentration共有成分引物/pmol模板DNAVngTaq酶/ (mol s-1)BSA/(g门)13014151(16.67x 10-92161718195(207:21100221251x Taq酶缓冲液8.34x 10-91.5 mmol L~ 'MgC22416.67x 10-2:0.1 mmo L-'4 x dNTP1025.01 x 10-92633.34x10-27中国煤化工280.5029MHCNMHG0.753(1.003116.67x10-91.50322.0032.50343.00第20卷第2期金则新等:大血藤RAPD条件的优化143进行PCR。1.4 PCR产物的鉴定扩增产物取15 μ山在2%琼脂糖凝胶(0.5xTBE,含5g L- l溴化乙锭)上进行电泳分析,于上海天能GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)拍照保存。2结果与讨论2.1 大血藤DNA的提取及分析按方法所述对大血藤嫩叶DNA进行抽提,经0.8%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射反射分析仪中分析结果见图1。结果显示大血藤DNA分子量在23 kb以上,确定是基因组DNA。2.2 Mg2+ 浓度与dNTP浓度对RAPD带影响不同Mg2+浓度与dNTP浓度的组合对RAPD扩增结果的影响如图2所示。由图2可知, dNTP浓度对扩增结果影响较大，当dNTPThe genomic DNAof--王人DNAHin dIII molecularSargentodoxa cureataweight standard浓度较低(0. lmmot L-1)时,扩增产物条带较少,并且随着Mg2+ 浓度的升高,扩增的条带数明显增加,亮度也明显增加。当Mg2+浓度为1.5mmotL1和1.8mmotL1时,只出现.分子量较小的条带,当Mg2+浓度升高至2.0mmol L和2.4 mmol L-1时,扩增条带数目增图1大血 藤DNA凝胶电泳结果加,但仍缺少分子量较大的2条带。当dNTP大血藤DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳(含5g L-溴乙锭)鉴定,浓度升高至0.15 mmot L-'以上时 ,具有清晰1xTAE缓冲液,6 V cm-'电压强度Figure 1 The agarose gel analysis of Sargentodoxa cuneata DNA的扩增结果,并且Mg2+浓度的改变对扩增结Sargentodoxa cuneala DNA was determined on 0.8% agarose gel ( including果影响不大。由于较低的Mg2+浓度有利于增5g L ' EB), 1xTAE bufer , 6 v cm-1 volage intensity强PCR扩增的特异性,因此最适Mg2+浓度选择1.50mmotL-1,dNTP浓度0.15mmolL-1为最适的组合浓度，此时RAPD条带最清晰,条带数最多,亮度最大。2.3 引物量对RAPD带的影响在本研究中,引物量的变化对RAPD带的数量和强弱影响较大(图2)当引物量为10 pmol时,分子量较大的条带亮度较低;当引物量增高至15 pmol和20 pmol时,扩增产物条带最清晰，亮度最大;当引物量继续增高至25pmol和30pmol时,出现明显的引物带,并且某些条带的亮度反而减弱。根据结果选择最适的引物用量为15 p山RAPD反应体积中添加15 pmol引物。M 1234567891011 121314 I5 1617 18 1920 21 22IIIILIIII中国煤化工图2几种因素对大血 藤RAPDHHCNMHGM: ADNA/Ec RI+ Hind II 标准分子量参照物1-22:方法1.3表2中管号1-22的RAPD扩增结果Figure2 The ffect of amplifcation conditions on Sargentodoxa cuneata RAPD amplifcation ( primer S21 )M: ADNA/Eco RI+ Hind II moleular weight standard. 1 ~ 22 : The RAPD aplifcation of1- 22 eppendorf lsed in the table 2 in method 1.3144浙江林学院学报2003年6月2.4 模板DNA量对RAPD带的影响如图2所示,模板DNA的量对RAPD扩增结果有明显的影响。当模板DNA量为25ng或50ng时,扩增的条带量度太重大，导致电泳条带的重叠;而当DNA量增加至75ng时，扩增的条带清晰,但当DNA量继续增加至100 ng以上时，扩增的条带反而减少。由于本实验所用的模板DNA未经纯化，且大血藤叶中含大量的图3模板DNA量对大血藤RAPD扩增的影响(引物S21)M: ADNAVEco RI+ Hin d II 标准分子量参照物次生代谢产物,因此分析原因可能是所提1~4:模板DNA量分别为1 ng,5ng, 10 ng和20 ngDNA中含有一定的次生代谢产物,抑制Figure 3 The effect of the content of the template DNA on Sargenodoxa auneata.了RAPD的扩增。为了进一步确定模板.RAPDamplification ( primer S21 )DNA的量,我们对1~20ng的模板DNAM: ADNA/Eco RI+ Hin d Il molecular weight standard. 1 ~4 : The content量进行分析，结果显示模板DNA量为1of the template DNA was 1 ng, 5ng, 10 ng and 20 ngng时,扩增的条带数较少;当模板DNA量增加至5~20ng之间时,模板DNA量对RAPD扩增结果影响不大,均可获得清晰的条带(图3)我们最终选择最适的引物用量为15 pμL RAPD反应体积中添加10 ng模板DNA。2.5 Taq酶单位对RAPD带的影响Taq酶单位的变化对RAPD带的数量和强弱影响较大(图4)当Taq酶为8.34x 10-9mot s-1时扩增的条带数较少;当Taq酶用量增加至16.67x 10-*mot s-'时,条带数目有所增加,但有些条带仍模糊不清;当Taq酶用量增加至25.01x 10-9mol s-'时 ,可获得清晰的扩增结果;当Taq酶用量再增加至3..34x 10-9mol s-'以上时,对扩增结果有所影响，分子量较大的条带反而丢失。这与一些文献8报道相符:酶量过高,反而引起RAPD扩增效果的降低。我们最终选择最适的Taq酶的用量为15μL RAPD反应体积中添加25.01x 10-9mot s-1 Taq酶。2.6 BSA浓度对RAPD带的M232425262728293031323334影响BSA浓度的变化对RAPD带的数量和强弱有-定的影响(图4)当BSA质量浓度为0.5g L一'和0.75g L-'时,扩tli II增的条带较弱,有些条带丢失;当BSA质量浓度增加至1.00~2.50g°L-1时，对RAPD扩增结果影响不大,带图4Taq酶和BSA浓度对大血藤RAPD扩增的影响(引物S21)型变化不明显;当BSA质量M:λDNA/EcRI+HindII标准分子量参照物23~34:方法1.3表2中管号23~ 34的RAPD扩增结果浓度增加至3.00g L-1时,有些条带发生丢失。我们最终选Figure4 The effect of the unit of Taq polymerase and the concentration of BSA on Sargentodoxa cuneata择最适的BSA浓度为2.00 gRAPD amplification ( prim中国煤化工M: λDNA/Eco RI+ Hind IThe PARD aplfcationof 23 ~ 34 eppendorf listed:TYHCNMHG3结语由实验结果可知,扩增条件的变化会对RAPD图谱产生较大的影响,从而影响RAPD分析的准确性,而RAPD带谱的准确性与稳定性是利角据PD标记进行遗传多样性分析的前提条件。从以上分析可看出大血藤的RAPD分析较第20卷第2期金则新等:大血藤RAPD条件的优化145适宜的扩增条件如下: 15 pμ PCR反应体积，1x Taq酶配套缓冲液( 10 mmot L-'Tris HCI pH9.0, 50mmol L-1 KCl, 0.1%Trion X-100), 1.5 mmot L-1 MgCl2 , 25.01x 10-9 mot s-I酶(上海华美公司),10ng模板DNA，15 pmol 引物(上海Sangon公司), dATP , dCTP , dGTP和dTTP各0.15 mmot L-1 ,2.00g L-'牛血清白蛋白。以此条件对同-大血藤植株DNA进行3次RAPD分析,结果可靠,带型稳定。参考文献:[1]应俊生.张玉龙.中国种子植物特有属[ M]. 北京:科学出版社, 1994. 536 - 539.[2]王景祥，浙江植物志:第2卷[M]. 杭州:浙江科学技术出版社, 1992. 306.[3] Rmoker G, Mayer R , Shin-Kim J s. 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It is necessary to explore the reaction conditions. Thegenomic DNA of Sargentodoxa cuneata is extracted with improved SDS method and RAPD amplification is carriedout. The effect of content of Mg , Dutp，DNA templates , primers and DNA polymerase on experimental results istested and the optimal reaction system of RAPD for Sargentodoxa cuneata is determined as follows : 1 x Taqpolymerase corresponding buffer( 10 mmol L- 'Tris HCl pH9.0 , 50 mmol L-IKCl, 0.1% Triton X-100, 1.5mmol L 'MgCl2), 25.01x 10- 9mol s- 'Taq DNA polymerase，10 ng template DNA , 15 pmol primer , 2.00 gL~ 'BSA.0.15 mmol L~ 'dATP , dCTP , dGTP , dTTP for each in total 15 puL reaction volume. [ Ch, 4 fig. 2tab.8 ref. ]Key words : Sargentodoxa cuneata ; RAPD ; chemical composition ; medicinal plant中国煤化工MHCNMHG