吡硫醇聚乙二醇前药的合成与表征

广东药学院学报Journal of Guangdong Pharmaceutical College Oct, 2009, 25(5)吡硫醇聚乙二醇前药的合成与表征张围宇,王红,蔡波涛,胡春玲(湖北中医学院药学院湖北武汉430065)摘要:目的合成吡硫醇聚乙二醇前体药物,对目标化合物进行初步体外释放及刺激性试验研究。方法以单甲氧基聚乙二醇4000为原料,与丁二酸酐反应后再与N羟基丁二酰亚胺缩合得到活泼酯最后与吡硫醇反应得到目标化合物;用薄层色谱、紫外、红外、核磁共振氢谱对其结构进行表征。结果与结论合成产物的结构表征结果表明单甲氧基聚乙二醇4000成功地连接到了吡硫醇上;初步的体外降解及刺激性试验表明该前药具有一定缓释作用,且能显著减小对注射部位及血管的刺激作用。关键词:吡硫醇;单甲氧基聚乙二醇;前药;结构表征中图分类号:R914文献标识码:A文章编号:1006-8783(200)05-0493-03Synthesis and characterization of pyritinol-PEGZHANG Wei-yu, WANG Hong, CAI Bo-tao, HU Chun-ling( School of pharmacy, Hubei University ofChinese medicine, Wuhan 430065. ChinaAbstract: Objective To synthesize and characterize pyritinol-PEG prodrug, and assess its in vitro releaseand imitation. Methods mPEG4K was first reacted with succinic anhydride, and then treated with Nhydroxyl succinic anhydride, finally, reacted with pyritinol to give the target pyritinol-PEG which is theprodrug of pyritinol. Results The chemical structure of pyritinol-PEG was characterized by TLC, UV, FTIRand 'H-NMR. Conclusion The structural characterization of the target compound showed that mPEG4Kwas bonded to pyritinol. This prodrug has slow-release profile during in vitro release test, and significantlylow vascular imitationKey words: pyritinol methoxy polyethyleneglycol; prodrug; synthesis高分子量的聚乙二醇及其单甲氧基聚乙二醇等枝状及注射部位乃至整个上肢皮肤水肿、发硬痒痛由于其良好的水溶性生物相容性和无免疫原性以等不良反应。作者通过采用单甲氧基聚乙二醇的活及无毒等优点在前体药物的制备中有越来越多的化酯与吡硫醇合成前体药物3叫,以期改善吡硫醇应用12。吡硫醇临床上主要用于脑震荡综合症、药物半衰期短以及刺激性大的问题脑外伤后遗症、脑炎及脑炎后遗症等的头胀痛、头晕失眠、记忆力减退注意力不集中情绪变化等症1实验部分状的改善亦用于脑动脉硬化、老年痴呆等。临床主1.1仪器与试剂要用其盐酸盐,因其半衰期短,口服给药需每天3次很不方便;静脉滴注时,药物对血管黏膜有刺激RE52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);作用,易发生注射部位血管肿胀疼痛、呈青紫色树78HW型恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司);SKFG01电热恒温鼓风干燥器(湖北省黄石市医疗器械厂);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长收稿日期:2009-07-01;修回日期:2009-10-11城科工贸有限公司);Uv-1700紫外可见分光光度计基金项目:湖北省自然科学基金资助课题(200ABA213)作者简介:张围字(1981-),男在读硕士研究生,Ema:(日本岛津);DFY低温恒温反应浴(郑州长城仪器zhangweivusuper@163.com,通讯作者:王红(98-),有限公司);wRSB数字熔点仪(上海精密科学仪女教授硕士生导师,主要从事新药研究与开发,器公司); Perkin-Elmer Spectrum200FTR光谱仪Email:wanghonghb502@yahoo.com.cne(美国PE公司);AS600(600MHz)高分辨率核磁共494广东药学院学报第25卷振仪;ZF6型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有85%,mp56.3-58.2℃。限公司)。1.2.2吡硫醇聚乙二醇前药的合成参照文药用单甲氧聚乙二醇400mPEC4K)(南京威献进行合成试验研究。称取干燥的mPEC4K尔化工有限公司);吡硫醇(质量分数:98.5%,水A4.0g(0.1mmoL),用50 mL DMF溶解,0~5℃分:0.17%,批号:080519,上海新云化工有限公司提搅拌20min,依次加人NHs0.23g(0.2mmoL)和供);丁二酸酐、二环己基碳酰亚胺(DCC)、N羟基DCC0.62g(0.3mmoL),0~5℃搅拌10min,依次琥珀酰亚胺(NHS)、对二甲氨基吡啶(DMAP)、薄层加入吡硫醇0.48g(0.13mmoL)和DMAP0.16g层析硅胶GF、均为化学纯,N,N-二甲基甲酰胺(0.13mmoL)。0~5℃反应2h,30~35℃下反应(DMF)、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、甲醇、吡啶、丙20h,停止反应,反应液过滤,滤液在快速搅拌下加酮均为分析纯入冷乙醚180mL,搅拌5min后置冰箱中静置301.2方法mn。过滤得浅米黄色固体,将固体用30mL水溶解,1.2.1单甲氧基聚乙二醇4000琥珀酸单酯过滤滤液用二氯甲烷萃取(35mL×3),用1mol/L(mPEC4KA)的合成参照文献[7-8]进行合成HCl洗涤(10mL×2)后再用水洗(15mL×2)。加试验研究。称取干燥的单甲氧基聚乙二醇4000人适量无水硫酸钠干燥,静置过夜。过滤干燥剂,滤(mPEC400040g(10mmoL),溶于150mL三氯甲液再用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液浓缩,快速搅烷中加入丁二酸酐2.0g(20mmL)和1.6mL吡拌下加入冷无水乙醚沉淀产物,过滤得浅米黄色粉啶加热回流反应48h,减压回收溶剂,残余物中加末40℃真空干燥24h(干燥剂为P2O3),得浅米入饱和 NaHco3溶液150mL使溶解,过滤,用80黄色粉末(吡硫醇的载药量4.89%),mp56.5mL乙酸乙酯萃取2次,水相冷却至0℃后用2mo59.2℃L的HC酸化至pH2左右,用二氯甲烷100mL分32结果与讨论次萃取,合并二氯甲烷层,无水Na2SO4干燥过夜。滤去干燥剂浓缩至粘稠快速搅拌下加入冷无水乙2.1合成醚300mL,放入冰箱静置,待产品完全析出后过滤吡硫醇聚乙二醇前药的合成路线如下。抽干,P2O3干燥,称重,得mPEC4KS35g,产率为CH3OCH2 CH2o-tCH2CH20TCH-CH2OHOCH2CH20tCH2CH20CH2CH20-C-CH2CH2COOHNOHcH2OCH2CH2O十CH2CH2OcH2CH2O一C-CH2CH2C-OCCDMAPCHaOCH2CH20-tCH2CH20+CH2CH20-C-CH2CH2C-R2.2表征醇前药,用DMF溶解分别点样于同一硅胶板上,以221熔点测定用毛细管法对目标化合物与吡丙酮石油醚甲醇(体积比l:1:1)为展开剂展开,硫醇进行熔点测定,得目标化合物的熔点为56.5~取出,晾干,置紫外灯(254mm)下检视吡硫醇斑点592℃,明显低于吡硫醇的2159~217.7℃推断与目标化合物斑点清晰,且两试样R值相差较大,目标化合物是不同于吡硫醇的其他物质。说明目标化合物是不同于吡硫醇的其他物质。2.22薄层色谱鉴別称取吡硫醇、吡硫醇聚乙二2.2.3紫外色谱鉴别分别称取吡硫醇及目标化第5期张围宇,等.吡硫醇聚乙二醇前药的合成与表征495合物少量溶于0ml…LHo中经适当稀释得3结论一定浓度的溶液分别在200~400mm波长范围内进行紫外扫描。结果:吡硫醇的0.1mol·LHCl本研究合成了吡硫醇聚乙二醇前药,经熔点测溶液在295.20mm有最大吸收,目标化合物的0定、薄层色谱、紫外图谱、红外光谱核磁共振氢谱表mol.L"HCl溶液在297,40m有最大吸收。结果征,表明mPEC4K成功地连接到了吡硫醇上。通过表明:目标化合物具有吡硫醇分子的基本结构;最大初步的体外降解及刺激性试验该前药具有一定缓吸收波长发生红移,mPEG已经连接在吡硫醇上。释作用,且能显著减小在注射过程中对注射部位及22.4红外光谱表征将目标化合物和各步反应血管的刺激作用。产物用压片法进行红外扫描,各图谱进行对比,得到参考文献目标化合物中可能的基团:352540cm-(酚羟基[1] GREENWALD RB, CHOE YH, MCGUIRE J,aa伸缩振动);1735.68cm(酯羰基上羰基伸缩振Efective drug delivery by pegylated drug conjugates[J]动);145532cm1,1349.52cm-1,1297.18cm1[2 GREENWALD RB. PEG drugs: an overview[J]. J94967cm(均为聚乙二醇骨架伸缩振动);110825Controll releas, 2001, 74(2): 159-171m(醚健不对称伸缩振动);2869.55cm-(吡啶[3] ABUCHOWSK1A, MCCOY RR, PALCZUK N C Effect of环上碳氢伸缩振动)。表明mPEG已经连接在吡硫covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity醇上。and circulating life of bovine liver catalase[J].JBiolChem,1977,252(11):3582-358622.5核磁共振氢谱表征由于 mPEGAK的相对[4] ABUCHOWSK1A, VAN ES T, PALCZUK N C. Alteration分子质量及氡的个数远超过所载的吡硫醇,所以在of immunological proprties of bovine serum albumin by图谱上很难看到吡硫醇的氢信号,无法准确积分氢covalent attachment of polyethylene glycol [J]. J Biol的个数。各氢的化学位移(8)如下:2.6~2.8Chem,1977,252(11):3578-3581(—0-CO-CH2-CH2C0_0-),3.3-3.4[5]公伟薛春佳冯军等单甲氧基聚乙二醇修饰L门冬(-0CH3),3.4-3.8(-0CH2),4.2~4.3酰胺酶的研究[].中国医药工业杂志,2005,38(5)336-339(一CH2-0-C0-)[6 LEE H, PARK TG. Preparation and characterization of2.3初步体外释放及刺激性试验mono-PEGylated ipidermal growth factor: evalution of in2.3.1体外释放试验参照文献[11-12]采用透itro biologic activity[J]. Pharm Res, 2002, 19(6):845析袋与紫外分光光度法,分别在0.1mol·L的HC0.1mo,L的NOH、及0.1m,的[7!成东,王亚辉喜明龙,等乙二行生物的合成研pH72的磷酸盐缓冲液3种不同的环境中对吡硫醇[8] YUKIO N, KAZUNORI K, MASAO K,a.Py(hyme聚乙二醇前药做了体外释放研究。结果:吡硫醇与glycol )and cyclodextrin as novel building units for单甲氧基聚乙二醇4000琥珀酸单酯的物理混合物molecular assembly and polyrotaxanes[J]. Polym Prepr在酸性、中性、碱性条件下,24h释放率均达90%以1997,38(2):529-533上;吡硫醇聚乙二醇前药24h后的降解情况分别为[9]叶海张灿沈文斌等.灯盏乙素聚乙二醇前药的合成与表征[J].中国天然药物,20064(4):283-286酸性条件下释放36%、碱性条件下53%、中性条件[o] GRENWALD RB, PENDRI A, CONOVER C,ea.Dng下26%;前药在不同条件下的释放速率大小为:碱deliver systems: 2, Camptothecin 20-0-poly (ethlene性>酸性>中性glycol )ester transport forms[J]. J Med Chem, 1996, 39232刺激性试验参照文献31,通过小鼠抓(20):1938-1940.挠试验大鼠舔足试验、大鼠尾静脉刺激性试验对吡[1]常军郑玉斌段久芳等含5氟尿嘧啶的聚乙二醇酯的制备与表征[]现代化工,2006,26(3):40-42.硫醇聚乙二醇前药做初步刺激性考察。小鼠抓挠试[12]孟繁娜,唐星,符纯美盐酸毗硫醇无痛型注射液的制验结果:供试组与阳性对照组、阴性对照组比较差异备[J沈阳药科大学学报,2006,23(12):754-756均有显著性(P<0.01)。大鼠舔足试验结果:供试[13] LOVELL M W. Less-painful emulsion formulations for组与阳性对照组比较差异有显著性(P<0.05),intravenous administration of clarithromycin试组与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。Pham,I994,109:45-57大鼠尾静脉刺激性试验结果:供试组的刺激性与阳[14 J CANNON J E. Reduction of pain on intravenous infusionwith bile salt formulations for a macrolide antibiotic[J]性对照组比较显著减小。int j Pharm,1995,114:65-74.