全细胞生物催化竹笋壳制备燃料乙醇的研究

第32卷第5期太阳能学报vol 32. No 52011年5月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICAMay,2011文章编号:02540096(2011)05073005全细胞生物催化竹笋壳制备燃料乙醇的研究王超,姬丽婷,林海萍2(1.渐江农林大学农业与食品科学学院,杭州311002.浙江农林大学林业与生物技术学院,杭州31100)摘要:以竹笋壳为原料,采用白腐菌(TST01)对其进行预处理后,选择纤维素酶和木聚糖酶进行酶解,并在酶解产物中添加固定化混合菌种(嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母)进行乙醇发酵。结果表明:白腐菌表现出优良的木质素降解性能,经过24d,木质素的降解率达到621%;6%木聚糖酶和10%纤维素酶混合,在初始p值为4.5的条件下酶解6h,总糖转化率可达到67.54%;固定化混合菌种在发酵48h的酒精质量浓度可达到19.84g/L,高于游离混合菌种,也远高于单一菌种。关键词:竹笋壳纤维;白腐菌;酶降解;固定化混合菌种;燃料乙醇中图分类号:S2162文献标识码:A0引言量(干基)分别达到50%和75%以上。将这些来源广、产量高的纤维资源通过全生物途径转化为燃料以可再生的植物纤维原料生产燃料乙醇首先要乙醇,具有广阔的应用前景进行预处理。理化预处理方法需要专业的设备并消耗大量能源且容易造成环境污染。通过全生物途径1材料及设备转化植物纤维原料生产燃料乙醇的研究正如火如1.1材料茶1.1.1竹笋壳高效利用植物纤维原料的关键之一在于如何降采集自浙江农林大学后山,清洗后风干备用。解包裹在纤维素晶体外的木质素。王宏郧等研究1.1.2预处理菌株及其培养基了3株不同种属白腐菌对玉米秸秆木质纤维素的降白腐菌(TST0):浙江大学分离保藏解能力和规律;葛春梅等“探讨了里氏木霉和鸡腿种子培养基:葡萄糖20g/L,玉米浆40g/L菇利用秸秆共发酵产木质素降解酶的研究。但采用(NH4)2SO40.4g/L,KH2FO40.9gL,MsO4·7H2O全生物途径将植物纤维原料转化为燃料乙醇的工艺0.4gL,V0.5g/,pH值5.0过程和技术参数尚需深人探讨。本研究首先利用白基础培养基:酒石酸铵1mL、微量元素15mL、大腐菌(TST01)固体发酵的方法破坏木质素的复杂结量元素15mL,V3mL,加水至培养液体积为50mL,构”;再添加生物酶对纤维素和半纤维素进行降解,其中酒石酸铵(2.0gL)为氮源,大量元素每升含获得可被利用的糖类物质6;在乙醇发酵阶段,为20 g KH,PO4,13.8gMgO4·7H2O,1, Og CaCI2和0.6g充分利用水解液中的糖类物质,以嗜单宁管囊酵母NaCl,微量元素每升含035 g EnSO4HO,60 mg Feso4(P. tannophilus)与酿酒酵母(S. cereuisiae)共固定化·7H2O, 110mg CoCI2·6H20,95 mg CusO4·5HO,6mg来发酵原料水解糖液。AIK(SO4)2·12H2O,6 mg H3 BO3和6mgNa2MoO我国竹类资源十分丰富,全国竹林面积约72x2H20,60 mg ZnsO4·6H2O,Vm的质量浓度为100mg/L10°m2,鲜笋年产量已达217万t。在竹笋加工过PDA斜面培养基:马铃薯汁200g/L,葡萄糖程中笋基与笋壳均被丢弃,而笋基、笋壳粗纤维含20g/nH值白中国煤化工收稿日期:20100830基金项目:浙江农林大学预研基金(2008FK66);浙江农林大学大学生CNMHG学科研启动基金项目通讯作者:王超(1978-),男,硕士、讲师,主要从事发酵工程及生物质能源方面的研究。 tianshan@ zafu,. edu,cm5期王超等:全细胞生物催化竹笋壳制备燃料乙醇的研究7311.1.3酶解用酶处理前、后液体中的还原糖量。还原糖测定采用纤维素酶、木聚糖酶购自淅江腾天生物科技有DN比色定糖法(540mm)限公司,酶活分别为4000g和8000yg221单因子试验1.1.4发酵产乙醇菌株及其培养基设置pH值、酶的用量和原料处理方式等三因素嗜单宁管囊酵母(P. tannophilus):该菌种能够对竹笋壳酶解糖化的影响试验步发酵木糖和己糖浙江工业大学保存;酿酒酵母(1)竹笋壳糖化的起始pH试验(S. cereuisiae):浙江工业大学保存设置pH值分别为455.0556.065和7.0,酵母细胞培养基:葡萄糖20g/L,(NL)2SO,对竹笋壳进行混合酶水解糖化,测定水解后的还原5g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,琼脂20g/L糖量。酵母细胞液体培养基:葡萄糖20g/L,(NL)2(2)混合酶的用量试验5g/L,蛋白胨20g/L酵母膏10gL木聚糖用量分别为2%、6%和10%,对应的纤固定化增值培养基:葡萄糖20g几,木糖20g/L,维素酶量分别为5%、10%和15%,进行竹笋壳的混蛋白胨5g/L,酵母膏5g/L,KH4PO42g/L,MgO4·7mH10合酶的水解糖化测定水解后的还原糖量。(3)原料处理方式Ig/Le发酵培养基:竹笋壳水解液浓缩糖液设置白腐菌预处理后的竹笋壳采用直接酶水解、水洗剪碎到0.5cm、风干捣碎到0.5cm3种处理90-10g,(NH)SO5gL,酵母膏5gl,KBPO2gL,方式,进行混合酶水解糖化,测定水解后的还原糖MgsO4·7H2Olg/L量12设备2.2.2正交实验分析天平、生化培养箱、高速组织捣碎机、精密在竹笋壳水解糖化过程中,对起始pH值、混合pH计磁力加热搅拌器、分光光度计、电热恒温水浴酶用量和原理物理处理方式等3个因素,进行3个锅、酸度仪、北分瑞利Sp2100色谱仪等。水平的正交试验,以确定影响竹笋壳水解糖化的最2试验方法大因素,找出最佳工艺条件。正交设计表中水平与因子L(3)各因素的取值范围见表12.1预处理阶段表1正交试验因素水平设计L4(3)2.1.1白腐菌(TST01)种子培养Table 1 Factors and levels of orthogonal test L,(3)在250mL三角瓶中加入100mL种子培养基,于121℃,0.MPa下灭菌15mim,冷却。用10m无菌水水平pH值混合酶用量原料处理方式洗下保存于PDA斜面上的白腐菌并倒入上述的液X-2、C5直接酶解体培养基中,用四层纱布包住瓶口,置于水浴摇床,X-6、C10水洗剪碎30℃、180r/min振荡培养48~60h35.5X-10、C15风干捣碎2.1.2竹笋壳预处理注:X、C分别表示木聚糖酶和纤维素酶;X2、C5分别表示准确称取竹笋壳1og,加2倍于原料质量的基础2%的木聚糖酶和5%的纤维素酶培养基水溶液,于12l℃、0.MPa下灭菌15mn,冷却2.3乙醇发酵阶段后每瓶接入已培养好的菌悬液10%,摇匀30℃保温2.3.1酵母细胞菌悬液的制备培养,间隔4d取样,检测木质素纤维素和半纤维素将保存的试管菌种接入酵母细胞培养基上活的含量。化,酿酒酵母2d,嗜单宁管囊酵母4d,活化后的菌种2.2酶解阶段接入液体培养基中,在30℃、100r/min条件下活化在50m三角瓶中,加入经过微生物预处理后24,得中国煤化工的竹笋壳10g,木聚糖酶用量6%(以酶液对竹笋壳2.3.2CNMHG的质量分数表示)、纤维素酶用量10%,固液比1:10分取嗜单丁管襄醉母和酿酒酵母各4mL菌悬pH值为45,置于50℃恒温处理6h,重复3次,测定液与96mL3%的海藻酸钠溶液于常温下混合,注入太阳能学报32卷150mL2%CaCl2水溶液中,固化4h,用无菌水将固32单因素试验结果化后的海藻酸钠凝胶球洗涤3次,再移入150mL1%3.2.1竹笋壳糖化的起始pH值试验A2(SO4)3溶液中,放置4℃冰箱中固化24hpH值对竹笋壳水解糖化的影响见图2。从图223.3酒精发酵可以看出,pH值在4.5~5.5之间时,竹笋壳的糖化将增值培养后的固定化凝胶球用无菌水洗涤3率无明显差异,以pH值为5.0的糖化率最高,酶活次后,移入发酵培养基中。发酵液体积与凝胶球的性最大;在pH值为55时糖化率开始明显降低,当堆积体积为3:2,其中发酵液体积为50m,总体积为pH值为7.0时达到最低点。因此,pH值为5.0是竹80mL。固定化混合菌种置于30℃、100/mim摇床上笋壳酶水解糖化的最适pH值,总糖转化率为恒温发酵,固定化酿酒酵母置于30℃烘箱中静止发584%。酵。利用固定化细胞进行重复式发酵,即每一批发酵结束后,收集发酵液,接入新鲜发酵液。2.3.4乙醇含量测定发酵结束后,先对发酵液进行常压蒸馏,然后用部气相色谱检测乙醇含量。使用北分瑞利色谱仪10%FFAP填料柱3mx3m。色谱条件:进样器温H值度150℃,柱温110℃,载气H2流速20mL/min,进样图2pH值对竹笋壳酶解总糖转化率的影响量1L,检测器TCD温度为130℃。Fig 2 Effects of ph value on lignocellulosic degrading with enzymes3结果与讨论322酶用量的影响由图3可以看出,在一定的酶浓度范围内,随着31竹笋壳生物处理过程中组分的变化酶用量的增加,总糖转化率提高。木聚糖酶由2%在用白腐菌(T)对竹笋壳进行预处理的过增加到6%,纤维素酶从5%提高到10%,总糖化率程中定期取样进行组分测定观察生物预处理对竹提高了近10%;但木聚糖酶和纤维素酶的酶量再分笋壳组分的影响,结果见图1别增加到10%和15%时,总糖转化率增加不明显。50-纤维素一·半纤维素一木质素因此,酶用量以木聚糖酶6%和纤维素酶10%比较适宜。时间/dX-2.C.5X-6C-10X10、C-15混合酶用量图1白腐菌(TSTr01)处理期间竹笋壳木质纤维素含量变化图3酶用量对总糖转化率的影响Fig 1 Variety of lignocellulose in the period ofFig 3 ELects of enzymes concentrationdegradation by White rot fungi TST-01clarification由图1可知,经过生物预处理,竹笋壳中中木质3.23原料处理方式素的降解率最大,由处理前的156%降为62%,降竹笋壳纤维质不同预处理方式的酶水解糖化效解率为621%。而纤维素和半纤维素在处理24d的果见图4。图4表明,竹笋壳经过白腐菌预处理后,降解率分别为45.0%和37.4%。由此可知,TT01其作为酶解原料时的处理方式对酶水解糖化有明显菌具有优良的木质素降解性能。木质素被部分降解影中国煤化工达54.6%;而风干后木质素与纤维素半纤维素组成的复杂结构被破捣碎∏CNMH总糖转化率并不坏,有利于下一步酶解过程的进行。比水洗剪碎高,这可能是由于风干影响了酶的作用,5期王超等:全细胞生物催化竹笋壳制备燃料乙醇的研究733酶在水分存在时吸附于原料表面有助于水解的进酵母菌不能充分糖分。同时,为了探明固定化混合行菌种的发酵性能,对比研究了固定化混合菌种游离混合菌种、游离酿酒酵母、游离嗜单宁管囊酵母、固定化酿酒酵母和固定化嗜单宁管囊酵母分别发酵水解液的情况。由表3可知,固定化菌种的发酵效果均优于游离菌种。游离混合菌种在发酵48h的酒精质量浓度直接酶解水洗剪碎风干捣碎处理方式为1681gL,而固定化混合菌种在发酵48h的酒精质量浓度可达到19.84g/L。总体而言,固定化混合图4酶解原料物理处理方式对总糖转化率的影响菌种的发酵效果明显优于单一菌种,也优于游离混Fig 4 Efects of methods of material treatment on the合菌种。rate of saccarification表3不同类型菌种发酵结果对比33正交试验结果Table 3 Fermentation results for different microorganism正交试验结果以及因素水平极差分析的结果如菌种类型酒精质量浓度/gL表2所示。可以看出,在被考察的影响总糖转化率游离嗜单宁管囊酵母的3个因素中原料酶解前的处理方式影响最大,其固定化嗜单宁管囊酵母15.49次是酶解初始pH值混合酶用量影响最小。根据表游离酿酒酵母2的均值数据分析可知各因素的优化参数为固定化酿酒酵母15.24AB2C,即初始pH值45,混合酶用量为6%木聚糖游离混合菌种定化混合菌种酶和10%纤维素酶,酶解前原料的处理方式为水洗剪碎。在该条件下,总糖转化率达到6754%。4结论表2正交试验方案和结果Table 2 Results of orthogonal experiment for the rate of saccarification本研究采用生物降解木质素的预处理方式,添加外源酶水解纤维素和半纤维素,并采用固定化混试验号回值混合酶用量原料处理转化率合菌种将对糖类物质转化为乙醇,得出如下初步结方式论1)预处理阶段,白腐菌(TsT01)表现出优良的61.74木质素降解性能,经过24d,木质素的降解率达到2345678962.1%,同时纤维素和半纤维素也能适当降解。这对下一阶段纤维素酶和半纤维素酶发挥作用奠定了61.58良好的基础。相比较于化学处理方式,生物预处理33332.94方式不但能减少污染,而且还简化了操作工序;39.462)酶解时各因素水平的最优组合为:初始pH值为45,混合酶用量为6%的木聚糖酶和10%的纤K114588120014660维素酶;酶解前原料的处理方式为水洗剪碎。在该K2134.32132.4454.56条件下总糖转化率可达到6754%;K3120.021129311293k48.633)发酵产乙醇阶段,固定化混合菌种在发酵k244.7744.1551.5248h的酒精质量浓度可达到1984gL,高于游离混合k340.0137.6437.64菌种,V凵中国煤化工CNMHG3个阶段分步进3.4发酵产乙醇结果行达到∫较好时奴果。但在后实研究中,应探索将酶解后的糖液同时存在戊糖和己糖,单一选用其中的2个甚至3个过程耦合以及时消除反馈抑制32卷的影响,从而提高转化率。但乙醇浓度过高,将影响6] Hu Kuijuan,WuKe, Pan renrui,tal. Solid-state mixed菌株和酶的活性,必须及时析出乙醇,这些问题将是fermentation increases activities of xylanase and cellulose[J]以后研究的重点。Mycosystema,2007,26(2):273-278[7] Lin Jie, Tan Zhaozan, Luo Weicheng. Study on coferment[参考文献]tion using cassava residue by mixed cellulolytic strains[J].JSafety Environ,2005,5(6):26-27[1] Tyson K S, Bozell J, Wallace R, et al. Biomass oil analysis:Research needs and recommendations[门].NP5[8]谢涛,陈佩.竹笋壳纤维组分的组合分离技术研究[J.湖南工程学院学报,2008,18(2):72-7534796,2004[2]王超,章超桦.酶解纤维素类物质生产燃料酒精的9]李慧蓉白腐真菌生物学和生物技术M]北京:化学工业出版社,2005,166-167研究进展[J.纤维素科学与技术,2003,11(4):52[10] Kang Liping, Liu Li, Liu Ping, et al. Production of fuel etha[3] Wang Hongxun, Du Fuyou, Zhang Xiaoyu. Selective degra-nol from sweet sorghum stalks by solid-state fermentation[J]Transaction of the CSEA, 2008, 24 (7): 181-184dation of com straw lignocelluloses by white-rot fungi[J].JHuazhong Univ of Sci Tech, 2006, 34(3):97-1[11] Peng Yuande, Zheng Ke, Yang Xi' ai, et al. 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School of Forestry and Bio-technology, Zhejiang Agriautre and Forestry University, hangahou 311300, China)Abstract: After being pretreated on bamboo shoots shell fiber by microbial retting, foreign xylanase and cellulose werechosen for the use of enzymatic degrading. And Pachysolen tannophilus and Saccharomyces cerevisiae yeast cells were co-immobilized by entrapment in marine alga calcium gel. Fermentation of bamboo shoots shell fiber hydrolysate was studiedusing the immobilized yeast cells. The experiment results indicated that the degradation rates of lignin is 62. 1% aftercultivation for 24d by white-rot fungi. The highest rate of saccharification reaches 67.24% at the beginning of pH 4.5the optimal enzyme concentrations are xylanase of 6% and cellulose of 10%, respectively. The fermentation resultsare superior to those obtained with suspended multi-microorganisms, or separate samples of immobilized P. tannophilusor immobilized S. cerevisiae, and the ethanol yield coefficient reaches a maximum of 19 84g/LKeywords: bamboo shoots shell fiber; white-rot fungi enzymaticTYH中国煤化 Microorganisms;fuelCNMHG