铁钉菜乙醇提取物对真菌生长的影响

江西农业学报200,19(11):70-72Acta Agriculturae Jiangxi铁钉菜乙醇提取物对真菌生长的影响欧阳桐娇,郑怡2,刘艳如2,林勇3,郭文杰,江枝和3(1.福建省农科院生物技术研究所,福建福州35003;2,福建师范大学生命科学院福建福州350007;3.福建省农科院土壤肥料研究所福建福州350013)摘要:铁钉莱乙醇粗提物通过薄层层析法分离活性物质,分别采用纸片法和菌饼法测定了铁钉苿提取物及薄层层析带对3种真菌的菌丝生长的影响,用玻片法测定了对孢子萌发的抑制作用。实验结果表明:乙醇提取物对3种真菌孢子萌发的抑制作用最强,其中,浓度在0.005-/mL时对绿色木霉和黑曲拿孢子萌发的抑制率均达到9%。关键词:铁钉莱;薄层层析;真菌;萬丝生长;孢子萌发中图分类号:Q949.327.1文献标识码A文章编号:1001-8581(2007)11-0070-03QUYANC of etha n o ENt aCt fr ym iskig e r yAm u guo g w h n znhezhou 350003. China2. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China;3. Institute of Soil and Fertilizer, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, ChinaAbstract: Active substances separated by TLC from the ethanol extract of ishige okamura were used to study their effects on thehyphal growth of three fungi by using the method of disc and flter paper, as well as their restraining effects on the spore germination byusing the slide method. The results indicated that ethanol extract showed strong inhibition to the spore germination of three fungi anthe maximum inhibitory rate reached 97. 0% to Trichoderma wride and Aspergillus niger under the concentration of 0. 005 mg/mL.ls: Ishige okamura; Thin layer chromatographic analysis; Fungus; Hyphal growth; Spore germination海洋占地球总面积的71%,蕴藏着极其丰富的生物细菌、真菌对抗生素耐药性和抗药性的加强,寻找新的抗资源是有机物质的最大生产者。这些有机物基本上是菌活性物质已成为了当务之急。而海洋生物的多样性、海洋浮游植物合成的特别是海藻。因此可以说海洋藻特殊性及复杂性是理想的新的抗菌素的资源宝库。海藻类是世界上最大的有机物合成并储存的资源宝库并且抗菌活性物质的研究主要包括对具抗菌活性种类的筛它们在海洋中分布广泛从大洋水体到世界各沿岸海区,选抗菌活性物质的提取、分离纯化及化学成分分析和结生活环境变化多端,物种和生活环境的多样性为海洋藻构鉴定等。本研究以绿色木霉( Trichoderma viride)、黑曲类带来了其生物活性物质的多样性。由于海洋环境的特霉( Aspergillus niger)、圆弧青霉( Penicillium cyclopium)为殊性很多的海洋生物在高盐、高压、缺氧等恶劣生活环研究对象研究了乙醇提取物及薄层层析分离物对其生境的长期进化和发展的过程中为适应生存和竞争生存长的影响旨在为进一步开发利用海藻的天然活性物质空间形成并产生了许多结构独特而药理作用显著的海提供借鉴。洋次生代谢物质如抗菌、抗病毒、抗肿痼抗氧化等活性1材料与方法物质而海藻作为海洋生物链的第一生产者,为了抵1.1材料铁钉菜采自石狮海域;海藻采回后立即清洗抗外界微生物的感染和猎食者的吞食而获得生存,它们于净室内阴干阴凉处保存备用。在不断的进化过程中产生了对各种敌害生物的抗性。由1.2真菌本实验的供试真菌有3种即绿色木霉(mi于海藻本身没有像高等动物那样的细胞免疫系统它们 choderma tinde)、黑曲霉( Aspergillus niger)圆弧青霉的这种抗性是一种有目标地产生化学物质的防卫机制,( Penicillium cyclopium),由福建农林大学许文耀教授分一般为藻类产生的次生代谢物质。另外海洋藻类还是离纯化本实验室保存。很多其他消费者的活性物质的主要来源。自20世纪601.3试剂石油醚、丙酮、乙醇、乙酸乙酯均为国产分析年代人们提出“向海洋要药”的口号起,近40年来海洋纯薄层层析硅胶为青岛海洋化工有限公司产品。化学及生命科学研究成为热点之一12)。其中对于海14洋藻类抗菌活性物质的研究由来已久特别是随着很多司);SHH中国煤化工斯特仪器有限公CNMHG一州长城科工贸收稿日期:2007-08-06基金项目:福建省科技厅重点项日(2005N096)。作者简介:欧阳桐娇(1963-),女福建平渾人助理研究员从事植物资源化学研究工作。欧阳桐娇等:铁钉菜乙醇提取物对真菌生长的影响71有限公司);旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);电热恒28℃恒温保混培养6h,显微镜下观察并记录孢子萌发温水浴锅(上海医疗器械五厂);VD-650型桌上式洁净情况。以等量的乙酸乙酯为对照每处理重复3次按下工作台(苏州净化设备);电热手提式压力蒸汽灭菌器面公式计算孢子萌发抑制率:(上海医用核子仪器厂);TDCC2-3接触调压器(浙江正孢子萌发抑制率=(1-处理萌发率/对照萌发率)泰电器股份有限公司);双层铁皮电炉(上海申航五金电x100%器厂丹阳分厂);F-I型三用紫外分析仪(上海顾村电2结果与分析光仪器厂)。2.1乙醇提取物抗真菌活性通过对铁钉菜乙醇浸提1.5方法后得到的粗提物经薄层层析后取各个特征带的乙醇浸151铁钉菜样品的处理将已经在通风处阴干的铁泡液并以乙醇作为对照采用纸片法进行抗菌试验抗菌钉菜,用高速万能粉碎机粉碎保存于干燥器中备用。结果如表1所示通过薄层层析后R052对圆弧青霉的152铁钉莱的浸提液的制备取干铁钉菜粉末适量,抗菌活性明显增加,而对黑曲霉、绿色木霉的抗菌活性消加入5倍体积的有机溶剂(乙醚、乙醇),于50℃水浴锅失,R081的抗菌活性减弱。中浸提72h,常温下每3d过滤1次,再加等量的有机溶表1铁钉菜提取物及层析带的抗真菌活性剂连续3次,得到浸提液。提取物及层析带黑删赛绿色木霉圆弧育莓15.3粗提物的制备将浸提液经旋转蒸馏,直至把有乙醇提取物机溶剂全部蒸出获得干物质即是粗提物每一次旋转蒸Rf0.52馏时都要过滤两次。旋转蒸发时当蒸馏瓶中的有机溶0811.24注:表中数据为抑制圈直径(mm);-表示没有抑制效果。剂很少时,每隔30min称重1次,直至恒重15.4萃取将获得的粗提物以10倍的比例,倒蒸2.2铁钉菜乙醇提取物对菌丝生长的抑制作用以乙馏水充分振荡直到粗提物不再溶解同样以10倍的比醇作为对照测定铁钉菜乙醇浸提粗物和薄层层析带乙例倒人乙酸乙酯充分振荡至粗提物全部溶解然后把溶醇浸泡液对菌丝生长的抑制作用试验结果表明铁钉菜液倒入分液漏斗中,上下充分振荡后,放在铁架台上静置乙醇提取物及各薄层层析带对绿色木霉均没有明显的抑至分层将水相和乙酸乙酯相分别收集。萃取时振荡制作用;从表2可见,乙醉提取物、R0.52、R05、0.63对圆弧青霉的抑制率都随着时间的增加而降低,其定要充分静置后取乙酸乙酯相这样就配制成0.1B影中R0.5的抑制率最高,R(0.60反而促进其菌丝mL的粗提有机溶剂溶液。由表3可知,乙醇提取物及薄层层析的3个带即Rf1.55薄层层析分离方法制作薄层层析板称取薄层000、R063、Rf0.81对黑曲霉的抑制率随时间的增加层析硅胶10g量取30mL质量分数为05%的羧甲基纤而降低,H063对黑曲霾的抑制率较原粗提物高出116维素钠,倒入研钵内研磨10min,后铺板、颠板、在光线下29.5个百分点,而有些条带则表现出促进生长作用观察,直至板均匀为止,常温下自然风干。烘箱中100℃表2铁钉菜提取物及层析带对圆弧条件下,烘30min活化距离板边缘1.5cm处先画上膏霉菌丝生长的抑制率条基线然后将浸提液点到基线上。将板点好后,配制展培养时间乙提层剂将其倒入层析缸中再把板放入层析缸,等各个特(h)取物000.50.550.60.630.81征带分离后即可把板拿出。展层剂为丙酮:石油醚=12433.33.366.7-86733.3-66.736429-28.614.357.1-8.714.3-14.315.6特征带的制备对已经分离好的多个板观察展注浓度为00gmL出来的条带数计算出R值准备好试剂瓶收集特征带表3铁钉菜提取物及层析带对黑曲霉1.5.7菌丝生长抑制实验采用菌饼法进行生长速率菌丝生长的抑制率测定在PDA平板表面中心接种菌饼然后用移液枪取时间乙膀提h)取物0000.520.550.600.630.8120μ铁钉菜提取液,注射在菌饼周围。以等量的乙酸212.6153-2.5-4.1-1641x.5乙酯作为对照每处理重复3次。28℃恒温培养。观测3616712.6-20.8-12512.52.34.2菌丝生长测量直径连续测量3次记录数据。按慕立注:浓度为00gm义的方法计算抑制率菌丝生长抑制率=[1-(处理23铁钉菜提职物对孢子萌发的抑制作用对铁钉菜组生长直径一菌饼直径)/(对照组生长直径-菌饼直乙醇粗中国煤化工(以乙醇作为对照)进CNMHG-6。从表4看1.5.8孢子蒴发抑制实验采用玻片法往干燥洁净的出乙醇提取物的分离带斑052对圆弧青霉的孢子萌无菌口玻片凹孔中滴加100μ海藻提取液在超净合上发有抑制作用,而铁钉菜乙醇提取物在浓度0.005g/mL挥发至干;然后每孔滴加100μL配制好的孢子悬浮液,时抑制率达到了最高。从表5看出铁钉菜乙醇提取物江西农业学报对绿色木霉孢子萌发有抑制作用浓度为005g/m时林雄平等使用乙酸乙酯和水对海藻乙醇提取物进行抑制率达到了99%。从表6中可以看出,R0.52对黑曲萃取后对两萃取相分别采用薄层层析进行了初步分离霉孢子萌发的抑制率随着浓度的下降而降低并测定了不同层析带的抑菌活性,结果发现大部分薄层表4铁钉菜提取物及层析带对层析分离组分的抗菌活性均强于分离前的粗提物。作者圆弧青霉孢子萌发的抑制率%所做的实验也用薄层层析法分离了乙醇提取物表明大提取物及层析带浓度(g/mL)部分薄层层析分离组分都有抗菌活性可是没有粗提物0.0100.0050.00l的活性高。乙醇提取物R0.52本实验采取了菌饼法、玻片法、纸片法测定铁钉菜提取物对3种真菌生长的影响,其中纸片法是比较成熟表5铁钉菜提取物及层析带对的方法前人经常有使用纸片法的报道而其他2种方法绿色木霉孢于萌发的抑制率的报道较少。本文菌饼法、玻片法的实验结果与纸片法提取物及层析带浓度(g/mL)的实验结果还是比较一致的。0.0100.001乙醇提取物Rf0.555876参考文献:Rf0.60[1]刘湘,汪秋安天然产物化学[M].北京:化学工业出版社,2005,118-126表6铁钉菜提取物及层析带对[2] Selective cytotoxicity of marine algae extracts to several human黑曲霉孢子萌发的抑制率leukemic cell lines[J]. cytotechnology, 1997, 252(1-3):13提取物及层析带浓度(g/mL0.0100.005[3]董春景,贺娟,梁惠,等海藻提取物抑瘤活性及抗氧化作用乙醇提取物8092的观察[].齐鲁医学杂志,2006,4(2l):98-100.Rf0.52[4]慕立义,植物化学保护研究方法[M].北京:中国农业出版社,1994.80~813讨论5]陈灼华郑怡,庄惠如10种红藻和褐藻抗细菌抗真菌活性前人研究业已证明海藻中含有丰富的抗菌活性物的研究[].福建师范大学学报:自然科学版,194,10质并且有良好的抗细菌活性。但对海藻提取物中是否有抗真菌活性物质尚存在争议。有研究表明,海藻6徐年军,范晓,韩丽君等海藻乙醇提取物抗菌活性的研究提取物的抗细菌活性和抗真菌活性相当。而有的试验结[.海洋与湖沼,200,3(2):265~270.果表明海藻提取物没有抗真菌活性。 Sreenivas和had[7] ZHENG Y, CHEN Y S, H. Screening for antibacterial andantifungal activities in some marine algae from the Fujian coast ofakuma发现海藻提取物具有抗真菌活性。陈灼华等China with three dierent solvents[J]. Chinese Journal Oceano和 Zheng,etl的研究也都证明了海藻提取物的抗真菌 yy and Limnology,x00,9(4):x7-3活性。作者所做的实验表明铁钉菜乙醇提取物有一定的[8]林雄平,郑怡,陈晓清.三种褐藻乙醇提取物抗动植物病原抗真菌活性。菌活性[J].福建师范大学学报:自然科学版,2005,21海藻提取物中有许多的活性物质。徐年军等和1):12(上接第的9页)油脂,00,(6参考文献:[S Cora J Dillard, German J B. Review phytochemicals: nutraceuti[1]戴洪平,王兴国,金青哲HPC法测定芝麻油中生理活性成cals and human health [J]. J. Sci. Food Agric. 2000, 80分芝麻素[食品科技200,(3):86~88[2]王可成王虹胡麻名考中药材,19920(9):479-480[6]k P. Suja, A. Jayalekshmy. Antioxidant activity af sesame3]s Sirat Yasumoto, M Katsuta. Efect o sesame sceds rich incake extract [J]. Food Chemisesamin and sesamolin on fatty acid amidation in n liver [J]. [7] Lee-Wen Chang, Wen-Jye Yen. Artionidant activity o seJournal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(5): 2647ne coat [ J]. Food Chemistry, 2002, (78): 347-354[8]李伟红戴廷灿熊艳HPLC法测定畜禽内中沙丁肢醇的残[4]唐传核彭志英芝麻木酚素“芝麻素”研究概况[]粮食与TH中国煤化工CNMHG