作物秸秆实验室条件发酵制乙醇研究

江苏农业科学2013年第41卷第1期245勉,翁海波,李萍萍,等.作物秸秆实验室条件发酵制乙醇研究[J].江苏农业科学,2013,41(1):245-246作物秸秆实验室条件发酵制乙醇研究覃勉,翁海波,李萍萍,孙武举,晋果果(郑州大学生物工程系河南郑州450001)摘要:利用具有高效产酶的菌株土曲霉M对作为底物的3种秸秆进行固体发酵研究探讨秸秆种类颗粒度、湿度、生长时间4个条件对产酶发酵过程的影响。结果表明,产酶发酵最适合的工艺是颗粒度为0.8mm的芝麻秸秆,湿度80%,产酶生产时间是7d,最适反应条件下乙醇产量为23.56mg/g关键词:秸秆;固体发酵;纤维素乙醇;土曲霉Ml1;工艺条件中图分类号:TQ923文献标志码:A文章编号:1002-1302(2013)01-0245-02我国是个农业大国,农作物资源十分丰富。作为粮食的生长培养基(PDA培养基):马铃薯200g煮水,加入葡萄副产物,秸秆的处理方式通常是焚烧。每年处理秸秆时产生糖20.0g琼脂15.0g,加水至1000mL混匀。基础盐溶液的气体,不仅污染了环境还对农村生态环境造成了破坏。MO4·7H2O0.5g,CaCl20.5g,KH2PO43.0g,(NH)2SO秸秆的主要成分是纤维素。纤维素是植物通过光合作用转化3.5gpH值3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液1000mL。糖化发能量的主要载体,是重要的生物能资源,也是地球上资源量最酵培养基:蛋白胨5.0g,NH4C12.0g,KH2PO41.0g,丰富的可再生资源。若仅将秸秆作为燃料,对其能源的利用MgSO4·7H2O,pH值4.8的柠檬酸钠的缓冲溶液1000mL。率仅在10%左右近89%的能量被白白损失2。用秸秆生产酵母培养基:酵母膏10g,蛋白粉20g,葡萄糖20g,蒸馏水燃料乙醇可以大大提高其能源利用率,为解决能源危机提供90mL,琼脂20g(固体)。所用培养基均在10Pa下灭菌了更为理想的方法。20 mi采用生物技术生产秸秆纤维素乙醇,首先是利用纤维素1.3仪器酶将秸秆中的纤维素降解成还原糖,然后进行生物发酵生产烘箱,粉碎机,血球计数板,超净工作台,培养箱,恒温摇乙醇。用以处理秸秆的纤维素酶,也是广泛应用于食品、饲床,pH计,722W微机型分光光度计料、造纸纺织工业的一种重要的生物制剂。纤维素酶的1.4方法生产,是所有纤维原料生物转化中的关键环节,也是成本最高试验流程:秸秆处理粉碎→蒸煮杀菌→接种产酶及酶处的一个部分。研究表明,使用固态发酵方法生产纤维素酶,如理→乙醇发酵→燃料乙醇用秸秆等纤维原料直接生产纤维素酶,可以有效减少生产成1.4.1秸秆处理收集作物秸秆,冲洗,晾干,放入干燥箱中本。本研究采用笔者所在实验室自行分离鉴定的土曲霉充分烘干,便于粉碎。使用农业秸秆粉碎机进行粉碎转速菌株M11,它具有高效降解纤维素的活性,在实验室条件下,1000m/min,粉碎的颗粒直径分别为1.5、0.8、0.5mm。称使用固态发酵法,对同时作为产酶底物和纤维素原料的几种取不同颗粒度秸秆原料,以20g为单位,加入基础盐溶液培秸秆原料进行研究摸索新型的乙醇发酵方式旨在为利用秸养基,在10Pa压力下高压蒸汽灭菌。秆为原料工业化生产乙醇提供依据。将土曲霉Ml接种在PDA培养基上,45℃培养7d使之形1材料与方法成成熟孢子。用5m灭菌生理盐水冲洗培养基收集孢子,并用血球计数板计数控制溶液中孢子含量为10-107个/m,1.1材料在铁盘中装入不同颗粒度的4种秸秆原料,每份25g。小麦秸秆和玉米秸秆采自河南省郑州市沟赵乡祥营村,1.4.2产酶分解纤维素的正交试验采用正交试验研究秸芝麻秸秆产自河南省农业科学院芝麻试验基地。郑州大学生秆种类颗粒度、湿度、发酵时间等对纤维素分解成还原糖的物化学与分子生物学实验室提取分离鉴定的土曲霉M1l菌影响,并选定最适宜因素组合。选择上述不同因素的原因在株,具有耐高温耐强酸的高效降解特性。酵母菌也是笔者所于:以秸秆为原材料固态发酵生产纤维素乙醇的过程中接种在实验室分离的高效菌种。M11菌种须同步完成纤维素酶的生产和秸秆纤维素分解的1.2培养基过程。纤维素酶活性与土曲霉MIl菌种的生长状况直接相关。合适的湿度对于真菌生长十分重要。不同颗粒度的秸秆收稿日期:2012-04-09底物,也会通过通氧量和含水量影响真菌的生长状况。为保基金项目:河南省重点科技攻关项目(编号:07210222000)。证土曲霉M1生长良好,须选择最适宜菌种生长的底物种作者简介:覃勉(1987-),女,河南郑州人,硕士研究生,从事微生类、颗粒度、湿度。产酶处理时间的长短也影响酶解纤维素生物与发酵研究。E-mail:qinnmian@126.com成还原糖的产量。还原糖的生成量将最终决定乙醇的产量通信作者:翁海波,博士副教授,从事微生物与发酵研究。E-ml:检测还原糖量,也需研究菌种产酶发酵的最佳时间。正交试hbweng@gmail.com.验因素水平见表1。246江苏农业科学2013年第41卷第1期1作物秸秆发酵正交试验因素水平表2作物秸秆发酵正交试验结果与极差分析因素水平A:秸秆种类B.颗粒度C:湿度D生长时间试验号因素水平还原糖量A:秸秆种类B:颗粒度C:湿度D:生长时间(mg)玉米秸秆2小麦秸秆23218.8493芝麻秸秆1.4.3糖化发酵产乙醇试验正交试验完成后将培养基移23122331223114.4218.723人250mL三角瓶中,加入糖化培养基,在恒温摇床中以45℃13.674120r/min混合24h。对处理过的培养基进行pH值测定将pH值调节为4.5,之后接种酿酒酵母发酵还原糖,密闭条件下37℃培养3d,测定乙醇产量。20.57916.54117.62016.17318.1231.4.4还原糖与乙醇测定使用葡萄糖标准溶液与DNS溶15.60619.11719.95018.631液反应,540mm处检测不同浓度标准溶液的吸光度,绘出散k21.24316.65419.26716.点图,拟合葡萄糖浓度标准曲线。正交试验结束后,各个样品5.6372.4633.094995与糖化培养基混合24h,使用DNs法监测各个试验样品中的还原糖含量,并计算还原糖转化率。取无水乙醇配制标准乙醇溶液,以不同浓度的乙醇标准溶液与重铬酸钾溶液反应,水08=00426x-01414浴后,测定600mm处吸光度,绘制标准溶液吸光值变化曲线,得出回归方程。经酿酒酵母发酵后,取上清液,测定在600mm处的吸光度,依照回归方程计算样品中乙醇的含量。2结果与分析2.1葡萄糖标准曲线15葡萄糖标准曲线如图1所示。乙醇含量(%)图2乙醉标准曲线y=0.074x+00883r=09926在此条件下,秸秆底物的纤维素酶解所得的还原糖浓度较高。目前,尚无对土曲霉作为产酶生产菌种底物的研究。相10比于小麦秸秆和玉米秸秆,以芝麻秸秆作为纤维素原料,可以产生较高浓度的还原糖,有进行进一步研究的价值250葡萄糖浓度(mg/m参考文献:图1葡萄糖标准曲线[1]周肇秋,马隆龙李海滨,等.中国稻壳资源状况及其气化/燃烧2.2正交试验结果发电前景[J].可再生能源,2004(6):7-9由表2可知影响还原糖产量的主次因素次序为秸秆种[2]黄琴贺稚非.纤维素类物质生产乙醇研究进展[]粮食与类>湿度>颗粒度>生长时间。最佳工艺为A3B2C3D2,即采油脂,2008(5):8-10.用芝麻秸秆,颗粒度0.8mm,湿度80%,发酵时间为7d。土[3] Jung E d,LaoG, Inwin D,eta. DNA sequences and expression in曲霉MIl生长的最佳湿度为80%,产酶发酵的最佳生长时间Streptomyces lividans of an exoglucanase gene and an endoglucanase为7d,这与之前的研究结论相符合。采用最佳发酵条件对芝gene from Thermomonospora fusca[ J]. Appl Environ Microbiol麻秸秆进行产酶发酵,获得的还原糖量为29.08mg,还原糖93,59:3032-3043的产率约为0.291g/g[4]Bielefeld M, Hollenberg C P. Bacterial beta-lactamase is2.3乙醇含量测定creted in Saccharomyces cerevisiae under control of the invertase采用最佳发酵条件,对完成糖化发酵的芝麻样品进行乙signal sequenced[ J]. Curr Genet, 1992, 21: 365-268醇产量测定。使用重铬酸钾法测定乙醇的标准曲线结果如]刘淑华鲁新洁张发群.固态纤维素酶曲的制备[打.微生物学通报,1992,19(3):151-153图2所示。对照图表,计算出芝麻秸秆转化乙醇的产量为[6]Chahal P S, Chahal D S, Le G B B. Production of cellulase in23.56mg/gsolid-state fermentation with Trichoderma reesei MCG 80 on wheat3结论straw[J]. Appl Biochem Biotechnol, 1996, 57/58: 433-442[7 ]Sun T, Liu B H, Li Z H. Enhanced cellulase producton in fed-batch本研究结果表明,土曲霉M1l生产纤维素酶的最佳工艺solid state fermentation of Trichoderma viride SL-1[J]. Joumal of是芝麻秸秆,颗粒度08mm,湿度80%,最佳生长时间为7d,Chemical Technology Biotechnology, 1997, 69: 429-432