制药行业液相分析的普遍适用梯度方法

液相色谱的方法开发（Method Develpment）不是一件容易的事情。该用什么流动相，什么色谱柱，梯度怎么设置，用什么温度，什么波长等等，对于刚入行的同学，是一件非常令人头疼的事情。
 

那么，有没有对于大多数小分子有机化合物都通用的液相方法 （Generic HPLC Method）呢?

理想是丰满的，但这一次现实却不是骨感的。

虽然我们找不到一个百分百放之四海皆可的液相方法，但是我们却找到了一个对于制药行业绝大多数小分子分析都可以作为起始条件的“通用”方法，在此基础上根据实际出峰情况做一些小调整，方法开始基本在一两个小时内就可以搞定。

该方法是由Michael W. Dong 2016年LCGC杂志上发表，我们得到作者的授权，把文章的内容作了摘要分享给大家。

• 选择表面多孔颗粒柱（superficially porous particles，SPP）的原因，是它能够提供相比其他同类色谱柱更高的柱效，以及对于碱性化合物更小的拖尾。

• 同时选择2.7um的粒径和3mm的内径能够更好地兼顾HPLC和UPLC的方法转移的需要，在流速和进样量上更接近最常规的4.6mm内径的色谱柱。

  

  在相同流动相条件下，不同色谱柱对NCEs混合物分析得到的色谱图的对比

  （a）色谱柱：Waters Cortecs C18+, 2.7 μm, 50 x 3.0 mm;

  （b）色谱柱：Waters BEH C18 column ,1.7 μm, 50 x 3.0 mm，显示出更严重的峰拖尾

• 选用50mm的柱长可以获得在速度和峰容量之间平衡的灵活性。在梯度时间（Time of Gradient）从一分钟增加到十分钟，峰容量（Peak Capacity）很容易就从100增加到了300，如下图 ：

梯度时间分别为（a）1min；（b）3min；（c）10min时的峰容量

• 选择 0.05%甲酸作为水相，主要是考虑到流动相更容易制备，同时在于质谱联用的时候可以具有更高的离子化效率。

• 选择乙腈作为有机相，是因为它的黏度低，产生的压力相对甲醇低。

※需要注意的是，在低波长检测（小于230nm）时，最好往乙腈里加入0.03% 甲酸来平衡AB两相流动相之间的吸收差，保证更好的基线平稳。

• 两段的梯度（乙腈：5%到60％，60％到95%）相比起一个大梯度（5%到95% 乙腈）更加适合药物小分子中疏水性较低化合物的分离。

• 选择1ml／min的流速是根据选择的色谱柱。

• 一般来说35-40度的柱温属于常规设置。

• 如果使用紫外检测器，波长可以根据目标化合物的最大吸收波长调整。

• 如果使用质谱检测器，在ESI正模式下从150 到1000 amu扫描对于绝大多数药物小分子化合物都是使用的。

这种2分钟通用HPLC / UV / MS方法的优点是分析速度快，峰容量合理，并能获取很多NCEs的优异峰形。希望今天的文章能够帮助你更容易地应对新液相方法的开发。

原文还对更多的色谱柱，流动相的选择做了对比测试，同时提供了多个实际的例子，如果有兴趣可以联系小编木木森森:

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