重庆大学王丹: 创新实现纤维素一步高效原位糖化, 构建反胶束的双相“酶穿梭载体”

我国已成为世界能源消费第一大国和碳排放第一大国。因此，为实现“碳达峰碳中和”、节能减排等目的，能源结构需要向可再生能源转变。生物质作为化石燃料的替代品，具有储量丰富、价格低廉、清洁等优点，被认为是一种未来最重要的可再生能源之一。全球植物每年生产的生物质约1400-1800亿吨，它所拥有的能量相当于目前全球能耗的10倍，而实际利用率不足2%。据2021年9月15日中国产业发展促进会生物质能产业分会发布的《3060零碳生物质能发展潜力蓝皮书》显示，我国生物质资源年产量约为34.94亿吨，相当于4.6亿吨标准煤，但实际上被转化为能源得以利用的生物质却不足6000万吨。因此，我国生物质资源的开发利用具有巨大潜力。但由于生物质结构致密，难降解，必须进行预处理和水解后才能实现其有效利用。传统化学法预处理和水解生物质存在能耗高、污染大等问题。

以 离子液体为溶剂，酶法水解生物质 作为一种极具潜力的绿色方法，引起了学术界和工业界的高度重视。 但预处理时间长，分步预处理和水解，离子液体中酶失活等问题，限制了离子液体中酶水解生物质的发展与应用。

针对上述生物质酶水解存在的问题，本论文开发了一种在生物相容性离子液体中同时进行预处理和酶解反应的一锅法的水解策略。构建了以反胶束为基础的酶穿梭室用于一锅法高效酶解木质纤维素，并研究了实现纤维素酶高活性以及纤维素快速降解的机理。

本论文在低温下实现纤维素的一步高效原位糖化，不需传统酶解工艺中存在的IL预处理以及后续的水洗移除IL，对于实现生物质高效水解为可发酵糖以及进一步转化为生物燃料和化学品具有重要意义 。

图1. 纤维素酶水解竹子生物质的两种工艺对比：预处理和糖化分离的常规水解（途径1）；在反胶束酶穿梭载体中同步ILs活化和原位糖化（路径2）

1、生物相容性离子液体中纤维素的酶解

首先，探究了四种咪唑类ILs（[Emim][CH3COO]], [Emim][DP], [Bmim][HOOC], [Bmim][Cl]）对木质素的提取率和对纤维素溶解能力及其对纤维素酶的毒性，筛选出了生物相容性较好且活化竹粉能力较强的IL [Emim][DP]用于后续的酶解反应。然后，为实现免除预处理和糖化分步进行引起的时间过长、废水产生较多、后续ILs回收困难的缺陷，进行了ILs中同步活化和原位糖化的研究。研究了ILs类型、ILs浓度、温度、酶量对水解生产还原糖的影响，选取了20% w/v的[Emim][DP]和6g L-1的酶量在50 ℃低温下进行酶解反应，16 h后获得了46.8%的TRS产率。

图2.（A）不同ILs 对TRS产率的影响;（B）不同浓度[Emim][DP]对TRS产率的影响;（C）不同温度对TRS产率的影响;（D）不同酶量对TRS产率的影响

2、表面活性剂协同离子液体促进酶水解

首先，选用了四种表面活性剂，包括： 非离子型表面活性剂吐温80和司班20、阴离子型表面活性剂AOT、阳离子型表面活性剂CTAB，用于提高纤维素酶活性和加速竹粉生物质的水解 。研究了不同表面活性剂添加量、酶活、水解时间对TRS产率的影响，选取了0.02 g L-1的吐温80在50 ℃低温下进行酶解反应，14 h后获得了58.3%的最大TRS产率。其中，非离子型表面活性剂吐温80可以通过减少IL对纤维素酶活性位点的竞争性吸附，使纤维素酶活性从82.3%提高到86.7%。

最后，通过XRD、FTIR、SEM表征，发现添加表面活性剂吐温80后，可以进一步提高[Emim][DP]的脱木质素以及降低纤维素结晶度的能力，从而强化破坏木质纤维素的致密结构的效果，有利于后续的酶解反应。

图3.（A）不同添加量的表面活性剂对TRS产率的影响;（B）不同添加量的表面活性剂对酶活的影响;（C）最佳添加量的表面活性剂对TRS产率的影响

图4. 未处理、[Emim][DP]处理以及Tween 80协同[Emim][DP]处理12 h 的竹粉的XRD图（A）和FTIR光谱（B）

图5. 未处理（A）、[Emim][DP]处理（B）以及Tween 80协同[Emim][DP]处理（C）12 h 的竹粉的SEM图

3、基于反胶束系统的酶穿梭载体中一步高效原位糖化

首先，构建了基于反胶束的酶穿梭载体作为木质纤维素原位糖化的微环境，所构建的反胶束体系可以提供纤维素酶和水解产物葡萄糖的水相，以及疏水木质纤维素的有机相，从而有效地实现木质纤维素的活化和糖化。然后，探索了反胶束体系中的含水量对酶活及TRS产率的影响。在含水量为6时进行了50 ºC的酶解反应，24 h后，TRS的最大产率为71.2%，相对酶活为91.2%。

最后，通过TEM分析，发现反胶束的酶穿梭载体成功构建，以及纤维素酶成功进入酶穿梭载体的微环境中，从而避免了与ILs的直接接触，因此能保持较高酶活性。

此外，通过CD测试，对不同体系中纤维素酶的二级结构进行了分析。发现反胶束体系中能保持纤维素酶较高活性是由于在反胶束酶穿梭载体中，刚性α-螺旋的含量进一步降低至53.4%，柔性结构含量升高，使得纤维素酶对底物的亲和力增大。

图6. 反胶束体系中不同含水量对TRS产率（A）及酶活（B）的影响

图7.基于反胶束的酶穿梭载体的TEM图。(A)酶穿梭载体，(B)含纤维素酶的酶穿梭载体

本论文构建了基于异辛烷-IL双液相反胶束的 双相“酶穿梭载体” ，用于提供一个微环境来保护和维持纤维素酶的高能构象， 以实现高活性的纤维素酶连续催化水解纤维素生产还原糖 。 在50 °C下酶解24 h后，实现了71.2% 的最大TRS产率和91.2% 的酶活性 。因此，本论文实现了在低温下木质纤维素的一步高效原位酶解，不需要IL预处理以及后续的水洗移除IL，有助于后续研究以经济高效的方式将生物质转化为生物燃料或基础化学品。

未来可以进行如下探究：制备纤维素酶和特异性酶的复合酶，以进一步提高纤维酶的水解能力；寻找对IL耐受性更高的纤维素酶，开发出更多对纤维素酶无毒且溶解木质纤维素能力强的IL；加强ILs和纤维素酶的回收再利用，减少IL的生产成本；在反胶束体系中酶解反应的动力学方面进行进一步的深入研究，以强化生物质糖化的反应过程。