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第一作者： Anna Fryszkowska
通讯作者： Anna Fryszkowska, Chihui An
通讯作者单位：默克公司
发展基于蛋白质激素的蛋白质胰岛素是个难度较高的课题，目前的有机合成方法存在显著的局限，比如难以对折叠结构的蛋白质反应、当面对含有多种官能团的时候反应选择性较低。
有鉴于此， 默克集团公司 Anna Fryszkowska 、 Chihui An 等 报道一些酶催化剂，能够选择性的将胰岛素的一种或者多种氨基官能团进行安装 / 消除保护基，这种酶催化功能化分子能够与亲电试剂反应，制备均质胰岛素结合物。进一步的，展示这种方法能够修饰一系列生物活性肽，用于发展肽诊疗试剂 / 探针。
斯坦福大学医学院 Danny Hung-Chieh Chou 等 对该研究进行总结、评述和展望。
蛋白质修饰的技术背景
随着药物分子的形式和生物学作用机制变得越来越丰富，蛋白质、肽等生物分子的选择性催化转化成为重要的有机合成领域。
蛋白质具有复杂的三级结构和多种多样的重复性功能基团。因此，通常需要在温和反应条件以较好的选择性方式对特定结构基团进行修饰，这个目标是目前反应方法学而言是重大挑战。
目前人们发展的能够修饰蛋白的方法通常基于蛋白质特定官能团的本征反应活性，通过对终端进行选择性修饰、对亲核性 /pK a / 重复性氨基的氧化还原电势等参数的微弱变化标记特定的终端官能团。这种方法的局限导致催化转化难以对各种各样的底物兼容，而且难以得到较高选择性。
图 1. 目前常用修饰蛋白质的方法：亲核试剂修饰氨基官能团
技术发展需求
图 2. 温和条件酶催化胰岛素选择性修饰
通过基因方法将 ( 非 ) 天然氨基酸或者可识别的序列插入到蛋白结构，能够位点选择功能性修饰把手，这种方法受到人们的重点关注。但是向生物分子种引入识别基团的过程不可避免的改变生物分子结构，这可能对功能产生巨大影响，并且降低方法学适用的生物分子类型。因此，发展能够进行大规模反应的新方法，通过位点选择性方式在蛋白上进行修饰，将加快新型生物探针 / 诊疗分子的发现。
胰岛素修饰的技术路线
在过去数十年间，糖尿病的流行导致人们需要发展安全性更高、疗效更好的诊疗技术。胰岛素有关药物的本征疗效较低，而且过量给药可能导致低血糖，因此治疗过程面临较高的给药风险，需要复杂的给药方法。
通过对胰岛素分子修饰，能够促进深入理解激活胰岛素的机理、结合剂的结构 - 性能关系，有助于发展具有控制血糖功能的胰岛素的安全药物。
本文新发展：工程酶催化技术路线
图 3. 酶催化位点选择性修饰方法
图 4. 酶催化技术合成 B29, B29′ 胰岛素二聚体
在这项工作中作者基于酶催化方法，改善胰岛素天然蛋白的生物结合反应。基于小分子反应保护基策略，首先对胰岛素选择性进行官能团保护，随后对特定位点进行选择性的按照需求修饰特定功能基团（比如糖、聚乙二醇、肽等结构），快速得到一系列胰岛素的衍生化产物。
酶催化技术。酶催化是一种非常合适的方法，能够快速对生物分子进行位点选择性修饰，酶催化反应能够在溶液与温和反应条件实现优异的化学 / 位点选择性修饰，目前酶催化生物结合方法的应用拓展了化学合成方法的种类。比如人们发展了多种水解酶对蛋白进行位点选择性修饰，从而发展抗体药物结合物、疫苗、线性肽 / 大环肽等。
作者发展的新型酶催化技术。基于之前报道通过青霉素 G 酰化酶（ PGA, penicillin G acylase ）对 N- 苯基酰基保护的肽进行脱保护的相关报道，人们发现酶能够选择性对苯基酰基进行反应，同时不会影响 C- 端的酯基。但是这种酶的催化反应活性较低，而且可能被一些底物抑制。
因此，作者从天然 PGA 出发，探索其是否能够识别胰岛素特定种类的裸露胺基自由基，生成了能够选择性保护不同胺基的 ( 苯酰基化 ) 胰岛素。通过这种方法得到了特定结构的化学连接，得到各种不同胰岛素生物结合结构。
从天然酶中筛选具有水解反应选择性的酶
从 >100 种市售 PGA 进行筛选水解三 ( 苯乙酰基 ) 胰岛素 2a ，筛选发现 7 种具有选择性水解能力的酶。其中 Achromobacter sp. 固定酰化酶选择水解 A1- 和 B29- 位点的酰胺，生成 3a 。大部分酰基酶生成含有一个或者两个苯酰基的混合产物（ 3a-3f ）， 通过水解反应动力学研究，发现酰基水解酶在不同位点的水解反应速率互不相同， 2a : B29>A1>B1 。
酶的进化实现位点选择性水解反应。由于水解反应过程中不同反应速率，作者认为，通过对酶进行演化，能够实现位点选择性反应效果。通过对酶进行四轮进化和高通量筛选，鉴定了 PGA B29-H Rd4 实现了更高的催化性能和 99 % 的选择性，以优异的产率和纯度生成 A1,B1- 双苯乙酰胰岛素 3b ；通过酶进化方式，经过 2 轮进化生成 PGA A1-H Rd3 ，在合成 B1,B29- 二苯乙酰胰岛素 3c 的过程中实现了优异的选择性（ 95 % ）。
工程化提高天然酶催化活性
虽然目前能够合成 3b 和 3c 两种胰岛素修饰物，但是这种合成方法需要首先化学合成修饰苯乙酰基团的胰岛素 2a ，这增加了反应所需步骤。与之对比，通过直接进行对 1 号胰岛素基底上选择性安装苯乙酰基团能够实现流水线的方式生成选择性官能团保护的 3 。
因此，作者发现当使用 PhAcOMe 作为官能团化反应物，通过动力学驱动位点选择性酰基化生成 3d-3f ，补充完整胰岛素的酰基化方法。发现进化前期 PGA 能够实现较好的选择性（ 97 % ），但是转化率比较低。通过进一步的进化得到 PGA A1-Ac Rd3 变体，在合成 3d 的反应中实现了 92 % 产率和 98 % 选择性。
基于这些较好的酶催化反应结果，进一步的作者对酶的结构进行进化，用于合成 3e 和 3f 。通过酶进化得到具有 B29 位点选择性反应能力的变体 PGA B29-H Rd4.2 ，同时通过调节反应溶液 pH 值，在合成 B29- 酰胺化的过程实现了 >95 % 的转化率。从而发现分别能够进行 B29- 酰基化的 PGA B29-Ac Rd6-CHis 、 A1,B29- 双酰基化的 PGA A1B29-Ac Rd3-Chis 变体。
表1. 天然蛋白功能化中进化出的PGA变体的活性和选择性
总结
总结 。通过进化得到 5 种工程化 PGA 变体酶，分别得到六种单 / 双苯酰基保护胰岛素（ 3a-3f ）。随后，考察了这几种变体酶的催化兼容性，药物分子的催化活性。
作者认为这种基于天然酶及工程化酶生物修饰催化剂的数量将变得越来越多，因此提高发现新型诊疗试剂的速度，促进治疗学的发展。通过结构测试方法的进展以及机器学习技术的出现，能够更好的理解蛋白质分子链与催化剂分子间的相互作用，从而有助于蛋白质工程、生物结合领域的发展。
参考文献及原文链接
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