科研 | 重庆大学（IF：11.2）：氨胁迫下影响厌氧消化性能的关键微生物系统类型（国人佳作）
科研 | 重庆大学（IF：11.2）：氨胁迫下影响厌氧消化性能的关键微生物系统类型（国人佳作）
Microeco2016
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编译：微科盟HushKuo，编辑：微科盟小编、江舜尧。
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氨抑制是造成商业化沼气厂运营过程中不稳定效能的最常见原因之一。本文采用宏基因组学和宏蛋白质组学分析方法，对不同功能菌对氨胁迫的敏感性、适应能力以及影响厌氧消化（ AD）性能的关键 微生物 系统型进行了研究。 醋酸盐代谢对氨胁迫的响应最为敏感，甲烷丝菌属 Methanothrix 的甲基辅酶M还原酶 的表达活性在氨浓度相对较低时受到抑制，通过反馈效应诱导 醋酸盐和其他短链挥发性脂肪酸（VFAs）积累。随着AD过程的进行，具有高氨耐受性的活性 甲烷八叠细菌属 Methanosarcina 的丰度增加，其与醋酸型甲烷化相关的酶活显著上调，引导 醋酸盐代谢和AD性能完全恢复。因此，微生物群落可以通过自我优化来应 对乙酸盐代谢抑制。相反，当总氨氮（TAN）和游离氨氮（FAN）分别增加到4846.95 mg N/L和337.46 mg N/L时，消化反应器中出现丙酸盐积累 （没有其他VFA），甲烷产量下降65%以上。此时，活性 的共营养 丙酸盐氧化细菌（SPOB）丰度下降了52%，与丙酸盐降解相关关键酶的表达明显下调。 主导的 Pelotomaculum 中下调的差异表达蛋白质的比例高达94%，表明这些功能菌的生长受到严重抑制， 且对氨胁迫的适应性较差 。因此，SPOB似乎是影响氨胁迫下AD性能的关键微生物系统型。氨通过 抑制琥珀酰辅酶A合成酶的表达来抑制 Pelotomaculum 的甲基丙二酰辅酶A途径，从而抑制了 共营养丙酸盐氧化。 本研究的结果为氨抑制的微生物机制提供了新的见解，并确定了在氨胁迫下影响AD性能的关键系统型。研究结果 进一步 阐明了富氮 废弃物 厌氧消化池的微生物调节目标。
论文ID
原名： Integrated multi-omics analyses reveal the key microbial phylotypes affecting anaerobic digestion performance under ammonia stress
译名： 多组学集成分析揭示氨胁迫下影响厌氧消化性能的关键微生物系统型
期刊： Water Research
IF： 11.236
发表时间： 2 022.2
通讯作者： 李蕾
通讯作者单位： 重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室
DOI： 10.1016/j.watres.2022.118152
实验设计
结果
1 氨对反应器性能的影响
图1显示了氨的动态变化和消化器 中的各种工艺参数。在启动阶段（1-40 d），TAN 、pH和FAN分别保持在736.31 ± 56.57 mg N/L、7.03 ± 0.01和8.12 ± 0.77 mg N/L，甲烷产量（MY）保持在0.46 ± 0.02 NL/gVS，与 先前报道的用于FW消化器的正常MY范围（0.4-0.5 NL/gVS） 相符。VFA浓度也保持在极低的水平。这表明已成功污泥驯化和高效的 反应器性能。在第41天引入高蛋白质废物后，TAN 、FAN和pH值增加。到第81天，TAN和FAN分别达到2276.60 mg N/ L和78.36 mg N/L，但中间代谢物（SCOD m 和VFAs）没有明显积累;此外，MY（0.48 ± 0.03 NL/gVS）甚至略高于启动阶段观察到的水平，这可能与该阶段使用的底物的生化甲烷电位较高有关（表S1）。因此，此阶段被视为稳定阶段（S）。
从第82天到第113天，TAN逐渐从2337.25 mg N/L增加到2956.35 mg N/L。FAN从第82天的78.48 mg N/L增加到第96天的100.80 mg N/L，随后 下降，并在第109天达到其最低值36.99 mg N/L。在此期间，观察到SCOD m 增加了57%，并且从第87天开始，各种VFA的浓度急剧增加，伴随着MY的逐渐下降。直到第105天，MY下降了58%，表明工艺性能受到严重抑制。该阶段被定义为不稳定阶段I（I1）。 先前许多研究人员已经在相似的氨浓度下观察到性能的下降。 然而，MY没有持续下降，因为自第106天以来，MY一直保持在0.24±0.01 NL/gVS（图1）。这可能源于VFA的快速积累降低了pH值，这导致FAN降低并缓解了消化器中的氨抑制。Astals等人（2018）指出，FAN和NH 4 + 都有可导致 典型的AD抑制 ；因此，其中一个因素的减少促进了性能的 恢复。此外，一些研究人员认为，水溶液中的毒性主要是由AD过程中的NH 3 而不是NH 4 + 导致的。
尽管TAN浓度持续增加，在没有采取任何恢复措施的条件下， 反应器性能从第114天开始恢复，这与上述观察结果一致。从第114天到第144天，MY恢复到0.51 NL/gVS ； 虽然在第120天出现了轻微的下降，但MY仍然在稳定阶段的范围内。各种VFA同时被快速消耗，该周期被定义为恢复阶段（R）。此时TAN（4511.10 mg N/L）和FAN（254.17 mg N/L）的水平超过了先前报告的大多数抑制阈值及其在I1期的浓度 。因此可见，高效的AD性能可能是微生物对氨胁迫的驯化和适应的结果。驯化和优化操作条件（例如添加微量元素或生物炭）已被证明是改善AD过程的氨耐受性的有效策略，TAN水平甚至可以达到10 g N/L。 虽然沼气产量和VFA浓度在R阶段均 恢复 ，但该阶段的SCOD m 浓度远高于S阶段甚至I1阶段。Shi等人（2017）指出，微生物在不利的环境条件下以细胞外聚合物质（EPS）的形式积累有机物。因此，增加的SCOD m 可能是可溶性EPS。在整个阶段I1和R中，醋酸盐是主要的VFA，并且它在第82天开始积累， 与其他VFA相比提前了1-5天；然后，积累的醋酸盐的消耗 比其他VFA 的消耗提前2天 。这表明I1期的氨水平会抑制乙酸盐代谢，但在持续的氨胁迫下可以恢复。然而，其他VFA的代谢抑制可能与醋酸盐积累引起的反馈抑制有关 ；因此，在醋酸盐代谢恢复后，反馈效应被解除 ，其他VFA的浓度降低。
第145天，TAN和FAN分别增至4846.95 mg N/L和337.46 mg N/L，SCOD m 和丙酸盐急剧增加，MY再次下降。虽然TAN和FAN的浓度从第148天和第146天开始下降，最终稳定在4130.02 ± 218.57 mg N/L和224.11±14.34 mg N/L，但MY继续下降，直到实验终止的第158天。与 稳定阶段 相比，MY降低了68%，表明反应器受到严重抑制。该阶段被定义为不稳定阶段II。现阶段TAN和FAN浓度的下降是出乎意料的。反应器中的TAN浓度主要与底物组成 、进料底物与排出的消化液的体积比、气体排放以及微生物生物质固定有关。在我们的研究中，基质为单批次制备且具有高均匀性，进料和出料的体积是恒定， 因此，氨的输入是恒定的。此外，尽管FAN是挥发性的，并且根据亨利定律可以蒸发到气相，但这种气液平衡似乎不足以导致FAN浓度的 骤然 变化。因此，氨的减少可能是由有机氮的微生物矿化减少引起的。SCOD m 在这一阶段的显著 增加支持了这一假设，因为这反映了系统中大量溶解有机物的积累。然而，I2期SCOD m 的持续下降与沼气生产的下降 不一致，表明SCOD m 可能不是反应器不稳定的原因。丙酸盐的增加与沼气产量的减少是一致，表明丙酸盐的积累可能是AD性能恶化的原因。
I2期丙酸盐浓度低于I1期（峰浓度633.38 vs. 894.46 mg/L）； 除丙酸盐外，没有其他VFA积累，表明该阶段不稳定的原因与I1期不同，丙酸盐代谢似乎直接受到氨的抑制。以前的研究表明，丙酸盐代谢对氨胁迫的敏感性低于乙酸盐代谢 ； 然而，一旦受到抑制，反应器性能就会不可逆转地恶化。由于COVID-19导致实验意外终止 ，产生的数据有限，我们无法就恶化的性能是否可以恢复做出任何结论。为了进一步分析氨胁迫下工艺不稳定的原因，本研究选取不同阶段的微生物样品进行了组学分析。
图1 反应器的工艺参数。黑色虚线划分不同的操作阶段，黑点表示微生物样品采集时间。
2 多组学分析揭示内源性氨胁迫对微生物及其代谢功能的影响
根据氨抑制下各状态指标的响应变化，整个实验分为五个不同的操作阶段：启动（第1-40天）、 稳定（第41-81天，S） 、 不稳定性I（第82-113天，I1） 、 恢复（第114-144天，R）和不稳定性II（第145-158天，I2）（图1）。为了深入了解氨抑制的原始原因并揭示其潜在机制，收集了第79天 、 第108天 、 第129天和第158天的样品进行多组学分析（图1），并分别标记为S 、I1、R和I2。
2.1 微生物组概况
有关宏基因组学和宏蛋白质组学分析的数据质量控制的信息如表S2和图所示。S2使用主成分分析（PCA）评估微生物群落的潜在功能（基于3级京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径）和活性蛋白质的变化。结果如图2a和2b所示；主成分分析轴可以解释较大 比例的差异（分别为98.74%和91.11%）。随着反应的进行，观察到基因和蛋白质水平的变化，表明活性蛋白质的潜在功能和表达逐渐受到内源性氨长期积累的影响。宏基因组分析涉及环境中全基因组的测序，可用于获取微生物群落的功能潜力信息。然而，鉴于某些基因可能无法表达，宏基因组分析的结果不能用 于推断微生物的实际功能。宏蛋白质组学分析可用于确定微生物组中存在的蛋白质，并且可以通过宏基因组测序相关参考数据库对蛋白质功能进行注释，为活性微生物的功能表征提供了直接证据。因此，主要在蛋白质水平上分析了微生物群落对氨抑制的响应机制。
随着AD过程的进行，DEP的数量增加（图2c）。具体而言，在比较I1和S时期或时R和I1时期中的样品时，观察到上调蛋白质的比例居多； 相比之下，在比较I2和R 时期 或I2和S 时期的样品时，观察到下调蛋白质比例更高 。因此，在I2 时期，微生物群落的代谢活性急剧下降，这可能源于微生物无法适应高氨条件。
图2 潜在功能的动态变化特征 （基于京都基因和基因组百科全书（KEGG）第3级途径）（a） 、 活性蛋白质（b）和微生物群落的差异表达蛋白质（DEPs）的视觉火山图（c）。虚线箭头表示 演替 方向。FC是 倍数 变化。c中的每个点表示注释的蛋白质，浅黄色点表示 显著 上调的蛋白质（p < 0.05），黄点表示 显著 上调的蛋白质（p < 0.01），浅蓝色点表示显著下调的蛋白质（p < 0.05），蓝点表示 显著 下调的蛋白质（p < 0.01），黑点表示未 显著 上调或下调的蛋白质。虚线框上方的值是DEP数量与蛋白质总数的比率 。
2.2 导致不稳定的潜在关键功能菌群
在不同时期取样的优势活性微生物分布如图3所示，可观察到导致碳水化合物降解的各种水解和产酸细菌，通过比较不稳定阶段的样品与稳定或恢复阶段的样品，未呈现明显的 丰度下降（图3a）。在I2期观察到蛋白质降解细菌略有减少，但这些细菌的丰度在I2期仍然高于S期（图3b）。在整个实验过程中，脂质降解细菌（图3c）和 共 营养醋酸氧化细菌（SAOB）（图3e）的相对丰度增加。I1期产甲烷菌没有 显著 减少，R期和I2期逐渐增加（图3f）。 上述涉及的代谢途径可能不是过程不稳定的关键。另一方面 ，氨基酸降解细菌的相对丰度逐渐下降，在I2期 可观察到丰度急剧下降了31.86%（图3b）。此外，I1期的共营养 丙酸盐氧化细菌（SPOB）没有 显著变化，随后在R期显著增加，但在I2期（图3d）显著降低了51.79%，I2期SPOB的丰度低于S和I1期 。这些结果表明，氨基酸降解细菌和SPOB可能是氨抑制的关键功能微生物。考虑到反应器中醋酸盐、丁酸盐和戊酸盐的严重积累，进一步 对活性微生物组（即氨基酸降解细菌、合成物和产甲烷菌）在响应氨浓度积累条件下相对丰度和蛋白质表达的变化进行了分析。
图3 显性活性微生物的分布（相对丰度≥1%）。（a）负责碳水化合物降解的水解和产酸细菌;（b）蛋白质和氨基酸降解细菌;（c）脂质降解细菌;（d）共 营养丙酸盐氧化细菌;（e） 共 营养醋酸氧化细菌;（f）产甲烷菌。a-c中具有网格的微生物具有水解和酸化功能，而没有网格的微生物仅具有酸化作用。
2.3 氨基酸降解细菌及其功能蛋白质表达谱
经分析，共鉴定出1231种与氨基酸代谢相关的功能蛋白质（表S3），由于这些蛋白质的功能多样性，这些功能蛋白质广泛分布在各种功能微生物中。在氨基酸降解菌中，与泰氏菌属 Tissierella 的 氨基酸代谢相关功能蛋白质有46种， 与阿米尼菌属 Aminivibrio 有关的 有44种， 与 Lutispora 有关的 有30种， 与水井坊氨基酸杆菌 Aminobacterium 有关的 有11种。
在实验过程中，高代谢活性的 Aminivibrio 丰度逐渐降低，在I2期观察到67%的降低 （图3b）。相比之下， Lutispora 的丰度仅在I2期 显著 降低（p < 0.05）， 其 他功能细菌在实验过程中不断富集。图4a和表S4显示了四种功能性细菌的DEP，它们 是由目标时期与以往时期的样品比较 确定。对于I1和S 时期 或R和I1 时期 的样品，观察到上调蛋白质比下调蛋白质更多，上调蛋白质的比例分别为67%和70%（图4a）。相反，在I2期和R期样品的比较中，观察到大量 Aminivibrio 的下调蛋白质，所有氨基酸降解细菌的DEP表达被下调（约62%）， 这与属水平微生物丰度的变化一致，表明I2期氨基酸代谢受损。I2期 Aminivibrio 的下调蛋白质主要参与次级代谢物（map 01110）和甘氨酸、丝氨酸 及苏氨酸代谢（map 00260）的生物合成（表S4）。氨基酸降解细菌中参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的DEP的表达下调约67%，表明氨基酸代谢受到严重抑制。氨基酸代谢受损导致氨基酸积累和氨氮释放减少， 证实了前述 预测SCOD m 在I2期的急剧增加可能与氨基酸降解细菌活性降低引起氨基酸积累有关 的假设 。氨氮的意外减少也可能与含氮物质的微生物矿化减弱有关。I2期 Tissierella 和 Lutispora 的上调蛋白质数量与下调蛋白质的数量大致相似，表明它们的代谢活动未受到氨的严重抑制（图4a）。I2期中所有氨基酸的DP均上调，表明它们对氨胁迫具有高度耐受性。这些上调的DEP来自 Aminobacterium colombiensegen ，并且都与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢有关，这表明这种细菌的富集有助于甘氨酸、 丝氨酸和苏氨酸代谢的恢复。这也可能是第一阶段后期SCOD m 逐渐下降的原因。虽然氨基酸的降解在I2期受损，但由于对氨具有高度耐受性的微生物的功能冗余，在长期适应后整体氨基酸代谢 可以恢复。换言之，氨对这些微生物的毒性可能是可逆的，氨基酸代谢可能不是系统微生物群落受到氨抑制的原因。
图4 活性功能微生物的差异表达蛋白质（DEPs）（a、b、c、d、e）和关键酶（f）的表达信息的数量。在a-e中，正值和负值分别表示上调和下调蛋白质的数量。FC是倍数 。在f中，黄色和蓝色分别代表 显著 的上调和下调，"_"表示该蛋白质仅存在于被比较的两个样品中的一个中。
2.4 丁酸盐和戊酸盐降解细菌及其功能蛋白质表达谱
丁酸盐和戊酸盐的降解主要通过β氧化过程（图S3），在该实验中共鉴定出164种蛋白质。主导属包括直立共养单胞菌 Syntrophomonas 、 Tissierella 、 Syntrophorhabdus 和解脂嗜热互营杆菌 Thermosyntropha （表S5）。 Syntrophomonas 和 Thermosyntropha 是共营养脂肪酸氧化细菌，可以通过β氧化降解C4-C18脂肪酸。由于芳香族化合物的降解通常首先涉及芳香酸向苯甲酸的转化，苯甲酸通过类似于脂肪酸β氧化的途径进行厌氧降解，芳香酸降解 Syntrophorhabdus 相关蛋白质得以表达。 Tissierella 通常是蛋白质降解细菌，表达了β氧化途径所需的所有酶，但这些酶仅参与C4-C6脂肪酸的β氧化。此外， Tissierella 还表达丁酸激酶（EC 2.7.2.7，buk） 、 磷酸丁酰基转移酶（EC 2.3.1.19，ptb）和乙酸盐CoA-转移酶（EC 2.8.3.8，ato），可将丁酸盐转化为丁酰辅酶A，通过β氧化途径进一步降解 ； 然而，它们不表达长链酰基辅酶A合成酶（EC 6.2.1.3） ，该酶可以将LCFA转化为长链脂肪酰基辅酶A。因此， Tissierella 可能是C4-C6脂肪酸降解细菌。
在实验过程中，丁酸盐和戊酸盐降解细菌（包括 Syntrophomonas 、 Thermosyntropha 和 Tissierella ）的总体丰度逐渐增加（图3b-c）。上调蛋白质和下调蛋白质的数量大致 与I1和S时期相当 ，表明丁酸盐和戊酸盐降解在I1期没有受到严重抑制（图4b）。这证实了 前文基于 物理化学分析的假设，即I1期丁酸盐和戊酸盐的积累主要源于醋酸盐积累的反馈抑制。 相比于R和I1时期样品，21个DP中，大约90%是上调蛋白质；因此，可以观察到 系统AD 性能的增强。然而，相比于I2和R期样品，22个DP中的大多数是下调的蛋白质（约68%），表明其代谢性能减弱。鉴于微生物群落活性也会受到底物可利 用性的影响（例如丁酸盐和戊酸盐的浓度），I2期的丁酸盐和戊酸盐浓度与S期相当， 进一步对比 研究了I2期和S期 的DEP（表S6）。通过比较I2和S时期检测到的 大量DEP 发现，其中大多数差异表达蛋白质 是上调的（61%）。这一发现 联合I2期丁酸盐和戊酸盐降解细菌的丰度高于S期的现象可以表明， 与S期相比，丁酸盐和戊酸盐的代谢在I2期没有受到抑制。因此，丁酸盐和戊酸盐代谢不是氨抑制的原因。
2.5 SPOB及其功能蛋白质表达谱
丙酸盐代谢途径中共注释了309种蛋白质（map 00640），主要包括丙酸盐活化过程和甲基丙二酰辅酶A途径（MMC途径）（表S7）（图S4）。来自丙酸盐降解细菌的丙酸盐活化相关蛋白质很少， 这是由于这些蛋白质具有 功能多样性。MMC相关蛋白质主要来源于 Pelotomaculum 和 Syntrophobacter 。 Pelotomaculum 是最主要的丙酸盐降解微生物（图3d），其丰度在I1期 显著 下降（p < 0.05），随后在R期完全恢复，然后在I2期 显著 降低49%（p < 0.05 ）。图4c显示了 Pelotomaculum 的DP，将目标 时期与前一时期进行比较发现 Pelotomaculum 的DP数量从I1期到R期增加，但上调蛋白质和下调蛋白质的数量几乎相同。在I2期和R期样品的比较中，有大量的DEP，其中约94%（15/16）被下调，证实该属的丙酸盐代谢活性受到严重抑制。在I2期的 Pelotomaculum 下调蛋白质中，其中7个是琥珀酰辅酶A合 成 酶（EC 6.2.1.5，sucC / D）（表S8） ； 这也是导致I2期大多数下调DEP富集的酶，表明该属丙酸盐代谢受损主要与琥珀酰辅酶A合 成酶有关。此外，共检测到8种来自 Pelotomaculum 的琥珀酰辅酶A合成酶，其中7种明显下调（FC < 0.5，p < 0.05）（图4f），表明该属所有琥珀酰辅酶A合成酶的表达在I2 时期急剧下降。在共 营养丙酸盐氧化（SPO）过程中，琥珀酸盐氧化 到延胡索酸盐的过程 由HM直接控制，因为催化该过程的琥珀酸脱氢酶（EC 1.3.5.4，frd）需要醌作为电子受体，而醌被氢化酶氧化产生H 2 。因此，这些反应要求HM将H 2 维持在低水平。大多数琥珀酸脱氢酶的表达在I2期没有降低，这证实了 Pelotomaculum 的活性降低，因为其琥珀酰辅酶A合酶被氨失活， 且这与产甲烷过程无关。
Syntrophobacter 不是主要的丙酸盐降解微生物，其相对丰度在实验过程中降低。在R和I2 时期均发现到其丰度显著 降低（p < 0.05）。通过比较 目标时期与前一相的样品发现，与 Syntrophobacter 丙酸盐降解相关的DEP通常在所有 时期 都下调。下调DEP的数量从R 时期开始增加，并包括各种功能酶，证实 Syntrophobacter 的丙酸盐降解功能从R 时期 开始受到严重抑制（图4c）。 Candidatus Syntrophosphaera 是在反应器中检测到的另一种主导SPOB，其丰度从S期持续 增加到R期，随后I2期 显著 下降（p < 0.05），表明它对氨的耐受性（图3d）。然而，没有检测到与丙酸盐代谢相关的功能蛋白质，这可能 由于 它们的低表达水平。因此，所有SPOB的活性在I2期受到严重抑制， 由于缺乏具有高氨耐受性微生物的功能冗余，它们可能是解释过程不稳定性的关键。
2.6 S A OB及其功能蛋白质表达谱
共营养醋酸盐氧化（SAO）是产乙酸盐阶段的特定过程 ，因为它可以在醋酸盐代谢被阻断时将乙酸盐转化为H 2 和CO 2 ，然后被HM消耗。 尽管研究中 检测到大量SAO相关蛋白质，但其中大部分来源于 产乙酸菌 和产甲烷菌，这与参与甘氨酸裂解和乙酸盐活化的酶的功能多样性有关。对于SAOB，本研究中仅检测到通过GCS途径降解乙酸盐的 Clostridium ultunense 以及 五种GCS相关 表达 蛋白质（表S9）。图4d和表S9通过比较 目标时期与前一期的样品，呈现了 Clostridium ultunense 的DP。对于I1和S时期 或R和I1 时期样品的比较， Clostridium ultunense 5种功能蛋白质的表达没有显著变化，但其中4种功能蛋白质的表达在I2和R相样品的比较中显著上调（p < 0.05），这与图 3e中 Clostridium ultunense 相对丰度的变化一致。这表明SAO途径在I2期的醋酸盐代谢中起重要作用，并且可以有益于AD性能。因此，可以排除SAO途径对工艺稳定性的负面影响。
2.7 产甲烷菌及其功能蛋白质表达图谱
产甲烷是AD的最后阶段，包括AM、HM和甲基营养性产甲烷 （图S6）。共检测出325种与3种产甲烷途径相关的功能蛋白质，主要由5种 主导 产甲烷菌表达（图3f）（表S10）。 乙酸营养型 Methanothrix 表达24种AM相关蛋白质，氢营养 型 Methanospirillum 、 Methanoculleus 和 Methanosphaerula 分别表达30 、60和17种HM相关蛋白质。 Methanosarcina 表达90种与 产甲烷相关的蛋白质，这些蛋白质在三种产甲烷途径中均具有较高丰度。
Methanothrix 和 Methanosarcina 都可以利用乙酸盐进行产甲烷。 Methanothrix 是S期中 丰度最高 的产甲烷菌，但随着AD过程的进行， 该菌持续 减少（图3f），这与它对氨的低耐受性 特性一致。在实验过程中， Methanosarcina 的丰度逐渐增加，并最终取代 Methanothrix 成为最主要的产甲烷菌（15%）（图3f）。据报道，该属的高氨耐受性与其在细胞簇中心形成低氨浓度的生态位环境的能力有关。在实验过程中， Methanothrix 的DEP逐 渐增加（图4e）。上调和下调蛋白质的数量在I1和S时期 样品的比较中几乎相同，而DEP中下调蛋白质的数量在R和I1 时期 以及I2和R 时期 （分别为10/11和29/32）的样品比较中高达91%，表明 Methanothrix 经历了氨胁迫的增加。虽然在I1和S 时期样品的比较中只观察到3种下调蛋白质，但它们都是甲基辅酶M还原酶（EC 2.8.4.1，mcrA/B），负责产甲烷的最后一步。 Methanothrix 的所有甲基辅酶M还原酶丰度降低（FC ≤ 0.72），表明AM途径受损（表S11和图4f）。因此，氨主要抑制了 Methanothrix 甲基辅酶M还原酶的表达，损害了 Methanothrix 的AM功能，降低了系统的醋酸代谢活性。然而，自R期开始以来，与前一阶段相比， Methanosarcina 中AM中涉及的乙酸激酶（EC 2.7.2.1） 、 磷酸乙酰转移酶（EC 2.3.1.8）和乙酰辅酶A脱羰基酶（ACDS）的表达在 目标时期中显著 上调，FC值分别高达148.38 、91.32和39.69（表S11和图4f）。乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶是将乙酸转化为乙酰辅酶A的功能酶；ACDS继续将乙酰辅酶A转化为5-甲基-ThM(S)PT，然后进入共同的甲烷化途径。与前一时期相比，与 Methanosarcina 的甲基辅酶M还原酶等共同产甲烷途径相关的DEP在R和I2时期也上调，甲基辅酶M还原酶在R时期 中的FC值最高，为250.49（表S11）。因此，尽管 Methanosarcina 在R期中不是最主要的，但由于蛋白质 显著 上调，乙酸降解活性得到加强。Hanreich等人（2013）还发现，丰度低于4%的产甲烷菌占已鉴定蛋白质总量的20-30%，表明AD系统中存在一些代谢过度活跃的产甲烷菌。
在实验过程中， Methanosphaerula 的丰度降低； Methanospirillum 的丰度首先增加，然后下降到明显低于I2期S相的水平（p < 0.05）; Methanoculleus 的丰度逐渐增加（图3f）。在 Methanosarcina 的贡献下，随着AD过程的进展，氢营养性产甲烷菌的总丰度增加。其HM相关DEP的动力学与微生物群落中不同微生物丰度的变异一致（图4e和表S11）。与前一 时期 相比，氢营养产甲烷菌的功能蛋白质在I1和R 时期 中通常上调。在I2期，由于氨耐受性有限，来自 Methanospirillum 的下调蛋白质的表达大大增加。然而，大量来自 Methanosarcina 和 Methanoculleus 的蛋白质因微生物对高氨水平具有耐受性而被上调。因此，下调和上调蛋白质的总数几乎相同。这一发现，结合I2期氢营养产甲烷菌的高丰度，表明氢营养产甲烷菌足以应对氨胁迫，并且HM活性未被氨严重抑制。
与甲基营养型产甲烷相关的蛋白质主要来自 Methanosarcina 。通过比较目标时期与前一时期的样品而确定的相关DEP如表S11所示。对于I1和S时期 样品的比较，DEPs的数量相对较小， 且下调蛋白质比上调蛋白质略多。然而，通过比较分析R和I1时期 以及I2和R 时期样品发现，DEPs的数量大幅增加，并且所有DEP都进行了上调。一些蛋白质的丰度在R期急剧增加，FC值高达122.24。 Methanosarcina 的甲基营养型产甲烷 功能在R期也大大增强。
综上所述，在高氨胁迫下，3种类型的 Methanosarcina 功能蛋白质表现出高表达活性。这一发现，结合 Methanosarcina 在I2期的绝对优势，表明它在长期氨胁迫下 仍能在高代谢水平上执行各种产甲烷功能，证实产甲烷过程不是反应器不稳定的根源。
3 氨胁迫引起过程不稳定的微生物机理
如图5所示， Methanothrix 在内源性氨积累过程中对氨最敏感。当TAN > 2337.25 mg N/L，FAN > 78.48 mg N/L时， Methanothrix de的甲基辅酶M还原酶的表达活性显著降低，降低了醋酸盐向甲烷的生物转化。随后，醋酸盐积累 ，其他VFA的反馈抑制也发生。最后，观察到MY显著降低，并且AD过程受到抑制。然而，在此阶段，活性产甲烷菌的总丰度仅减少了约4%，并且上调蛋白质的数量大于微生物 群落中下调蛋白质的数量，表明微生物群落具有很高的稳健性。随着该过程的进行，具有高氨耐受性的活性 Methanosarcina 的丰度增加，其AM相关酶的 活性显著上调，导致醋酸盐代谢和AD性能的完全恢复，证实了微生物群落可以通过自我优化来应对乙酸盐代谢抑制。醋酸盐代谢不是氨抑制的关键。当TAN和FAN分别增加到4846.95 mg N/L和337.46 mg N/L时，丙酸盐（没有其他VFA）积累，MY降低超过65%。现阶段，微生物群落 中下调蛋白质的比例远高于上调蛋白质的比例（35.00% vs. 22.31%），表明群落 活性 严重恶化。此外，活性SPOB丰度下降52%，丙酸盐降解相关关键酶的表达普遍下调， 主导 Pelotomaculum 中下调DEP的比例高达94%，表明抑制显著。SPOB通常是具有专 性功能的少数菌群成员，实验过程中 未观察到SPOB 菌群通过主导微生物的转变（敏感微生物主导向耐药微生物主导转变）和通过代谢途径转变来实现氨胁迫下的功能恢复 。此外，其丰度和下调DEP的 显著降低表明，通过自我优化和重建 恢复丙酸盐代谢可能难以甚至不可能实现。因此，SPOB可能是影响氨胁迫下AD性能的关键微生物系统型。此外，氨通过抑制琥珀酰辅酶A合 成酶的表达来抑制 Pelotomaculum 的MMC途径，从而抑制了 共营养丙酸盐氧化。
图5 氨在厌氧消化系统中的抑制机制。
结论
AD过程中醋酸盐代谢对氨最敏感，氨抑制甲烷丝菌属 Methanothrix 的甲基辅酶M还原酶 的表达活性，抑制醋酸盐代谢。然而，持续的氨胁迫可诱使主导的醋酸盐降解微生物从 Methanothrix 转变为 Methanosarcina 。后者具有高氨耐受性，可以通过由乙酸盐激酶、 磷酸乙酰转移酶和ACDS介导的AM途径促进醋酸盐代谢的恢复。相比之下，丙酸盐代谢对氨胁迫的敏感性较低 。 然而，在高氨胁迫下，活性SPOB的丰度降低了52%，与丙酸盐降解相关的关键酶的表达普遍下调，表明这些功能性细菌的生长受到严重抑制，并且它们不易适应氨胁迫。因此，SPOB是影响氨胁迫下AD性能的关键微生物系统 型。氨抑制了 Pelotomaculum 琥珀酰辅酶A 合成 酶的表达，阻断了MMC途径和丙酸盐积累。 未来的研究 需要更加关注SPO过程，以开发有效缓解氨抑制的微生物调节策略。
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