香港大学张彤课题组ES&T：环境样本中抗生素抗性基因的通用定量单位

图片摘要

成果简介

香港大学张彤教授课题组长期致力于研究抗生素耐药性的环境问题，取得 了一系列有国际影响力的重要研究成果。近期，他们联合 19 个国家 39 个通讯单位的 40 多位作者，合作在环境领域顶级期刊 Environmental Science & Technology 发表题为 “Toward a Universal Unit for Quantification of Antibiotic Resistance Genes in Environmental Samples” 的文章。此项工作从耐药基因（ ARG ）环境监测面临的挑战入手，综合考量了常用的耐药基因的定量单位，包括每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数、每个原核细胞基因组中的平均的 ARG 拷贝数、每个 16S rRNA 基因的平均的 ARG 拷贝数、 RPKM 、覆盖率、 PPM 等，进而建议统一使用 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 这个有明确生物学意义的定量单位（ ARG copy per cell ）来报道环境样品中抗生素耐药基因的相对丰度，从而在今后的研究工作和监测工作中，提高耐药基因定量检测的标准化程度和可比性 。

引言

图文导读

1. 1.    ARG 定量的不同算法

实时定量聚合酶链式反应（ qPCR ）和高通量 qPCR （ HT-qPCR ）这两种方法通常使用 “ 每个 16S rRNA 基因的平均的 ARG 拷贝数 ” 作为 ARG 的定量单位。这些方法的应用有时会因可用的引物 / 探针的数量而受到限制。

宏基因组学是一种被广泛使用的 ARG 定量分析方法，可以在一些方面克服 qPCR 的不足。虽然在目前常用的测序深度下，宏基因组分析方法在检测灵敏度方面仍然稍逊于 qPCR 方法，但在可以同时涵盖的 ARG 数量、生物信息数据库 / 工具以及数据共享平台方面，则具有明显的优势，已被广泛应用于 ARG 的环境监测。与功能筛选试验结合使用时，宏基因组学分析还可以发现新的 ARG 。另一方面，随着新的 ARG 参考序列不断增加， ARG 数据库也在不断扩大，现有的 DNA 序列数据集可以重新分析进行回顾性的研究。此外，随着长读长测序平台（纳米孔和 Pacbio ）的广泛使用，测序还可以研究 ARG 和移动遗传元件（ MGE ）的关系，也可以用于了解 ARG 的细菌宿主，以便做出更为全面的风险评估。

目前，不同研究中各自采用不同的单位进行宏基因组中的 ARG 的定量（见表 1 ），导致无法直接比较不同研究的报道结果。

表 1. 宏基因组分析中 ARG 定量的不同算法

例如， RPKM 在归一化过程中虽然考虑了 ARG 的长度以及测序深度，然而， RPKM 并无直接和明确的生物学意义。在转化为有生物学意义的单位时，需要做出某些假设再进行换算。 “ 每个 16S rRNA 基因的平均的 ARG 拷贝数 ” 提供了一种与 qPCR 数据相互可比较的有效单位。然而，不同物种在每个基因组 / 细胞中 16S rRNA 基因的拷贝数存在着较大的差异，因此比较不同研究的结果时仍然有难度 。

这篇文章的作者建议采用 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” （如果假设每个细胞有一个基因组，则等同于 “ 每个原核细胞基因组中的平均的 ARG 拷贝数 ” ）作为单位。这一单位归一化了测序深度、 ARG 长度以及数据集里的原核细胞数或基因组数，因此更适于表示样本中的 ARG 的相对丰度。 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 这一单位有直接而明确的生物学及临床意义，便于更好地进行数据比较，且可通过流式细胞仪、显微镜或内标法等方法获得实际的细胞计数数据，进一步转化为绝对定量。与 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 类似的另一个相关的单位是 “ARG 密度 ” ，它计算了 ARG 的 RPKM ，并通过 40 个单拷贝标记基因的平均 RPKM 进行归一化。 “ARG 密度 ” 的生物学含义虽然不直接，但实际上与 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 大致相同的。不过，其适用性存在一定局限，不适用于长读长宏基因组分析，因为根据定义和计算公式（表 1 ）， “ARG 密度 ” 是基于等长的序列数，因此不适用于纳米孔等非等长的长读长测序。

总的来说，不同的应用情景可能需要采用不同的定量单位，然而，共同使用一种有生物学意义的通用单位（ “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” ），将有助于系统且直接地比较不同研究中的 ARG 相对丰度水平。

1. 2.     典型环境样本中的 ARG 相对丰度

除了不同研究之间的可比性之外，另一个显而易见的问题是，采用不同的单位是否会导致不同的结论。为了说明这个问题，作者对典型环境样本中的 ARG 丰度进行了分析，并采用四种单位来表达结果，包括 PPM ， RPKM ，每个 16S rRNA 基因的平均的 ARG 拷贝数和每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数。对宏基因组数据集进行质控后，用 ARGs-OAP v3.2 和 SARG 参考数据库做定量分析（链接： https://smile.hku.hk/SARGs ），该工具在对 ARG 按抗生素类型、抗性机制、基因型和参比序列注释、分类和定量的同时，还能计算细胞数（通过比对原核细胞的 “ 必需的单拷贝的标记基因 ” 数据库）和 16S rRNA 基因的拷贝数（采用 Greengene 数据库），然后将 ARG 的相对丰度的定量结果用四种不同的单位表示出来。

相较于 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” ，选用其他单位进行 ARG 定量可能导致样品总丰度排序结果出现差异（如图 1 所示）。例如，当以 “ 每个 16S rRNA 基因的平均的 ARG 拷贝数 ” 为单位表示时，牛粪中的 ARG 丰度低于污水处理厂（ WWTPs ）样本，但当结果以 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 为单位表示时，牛粪中 ARG 丰度显著较高。这种差异的出现，主要是由于牛粪中的 “ 原核细胞平均 16S rRNA 基因拷贝数 ” 高于污水处理厂中的原核生物 。

此外，采用 PPM 或 RPKM 作为定量单位会淡化样本间的差异。例如，当以 PPM 或 RPKM 为单位进行评估时，海水和自然沉积物中的 ARG 总丰度无显著差异，但以 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 为单位时，两者存在显著差异。这种差异的出现是由于 RPKM 和 PPM 虽然都对测序深度进行了归一化，却未能反映出细菌基因组大小的差异。根据相关文献，沉积物中的细菌基因组大于海水中的细菌基因组。结果也发现，当以 RPKM 表示的 ARG 丰度值相似时，用 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 表示的 ARG 的丰度值在拥有较大细菌基因组的样本中较高。

1. 3.    讨论和启示

鉴于抗生素耐药性已成为全球关注焦点，科研探索与环境治理亟需系统的、定量的且可比的 ARG 数据集。采用合理的一致的 ARG 定量单位，将助于识别耐药性的主要来源和主要储库，为制定有效的应对策略提供指导，确定各国乃至全球健康领域的关键趋势。实现此目标需有标准化的手段，包括获广泛认可的一致的定量单位。当然，用于定量 ARG 的不同单位各具优势，适用于不同场景，相辅相成。然而，为了研究环境系统中的抗性基因组，这项研究的作者推荐以 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 作为一个通用单位（copy per cell），当然，实际应用中根据需要可以利用公式换算成其他单位一并报告，以便用于不同场景 。

宏基因组数据分析能通过多种方式计算得到细胞数（基因组数），与此不同的是，现行的 qPCR 通常测量 16S rRNA 基因的量，并将其除以一个估算或假定的 “ 每个细胞的 16S rRNA 基因平均拷贝数 ” 来估计细胞数量。后续研究中，建议设计针对多个单拷贝标记基因的引物，从而可以通过 qPCR 直接测定细胞数，从而在 qPCR 分析中更为方便地计算每个细胞的 ARG 拷贝数 。

根据表 1 中的公式，计算 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 时，需要分别计算分母（细胞数）和分子（ ARG 拷贝数）。值得指出的是，同一单位（ “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” ）下，相同的 ARG 总相对丰度值仍然可能具有不同的含义，因为其中包括的具体的 ARG 类型不同，相同丰度的 ARG 也可能具有不同的风险等级。另外，采用不同的阈值比对得出的 ARG 的总量也存在差异。从采样到湿实验的检测过程中其他因素的差异也可能对结果造成影响 。

“ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 仍是一种相对而非绝对的测量，要实现真正的绝对定量，还需要测量单位体积或单位质量样本中的细胞数。绝对定量和相对定量都是对环境中抗生素耐药性进行评估的必要条件，两者相互补充。前者提供关于扩散转移动态和暴露风险级别的信息，后者则为研究耐药性选择的过程以及对不同环境进行比较（比如高密度的肠道微生物组和水体微生物组之间的比较）提供可能。这是采用 “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 作为通用单位的另一优势，即在已知总细胞数或采用内标法定量的情况下， “ 每个原核细胞的平均的 ARG 拷贝数 ” 可以直接转化为绝对丰度的数据。如果使用碘化丙啶（ PMA ）这样的可以区分死活菌的试剂进行预处理，这一单位可以进一步转换为对携带耐药基因的活菌和死菌的绝对定量。

综上，该文章的作者建议在应用宏基因组学方法进行环境中抗性基因的研究时，采用 “ 每个原核细胞的平均 ARG 拷贝数 ” 作为一个有明确生物学意义的通用单位，以此增加不同研究的可比性，迈出分析方法标准化的第一步，同时和临床医学数据密切关联，从而更好地在 “ 同一健康 ” 的框架下应对抗生素耐药性的挑战。

此外，上述定量单位也适用于其他功能基因的定量，包括抗重金属基因、抗消毒剂基因、毒力因子基因以及携带这些基因进行水平基因转移的可移动遗传元件等。