山东大学姜威课题组Small：二维MoS2纳米片暴露引发细胞铁死亡分子机制
山东大学姜威课题组Small：二维MoS2纳米片暴露引发细胞铁死亡分子机制
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近日，山东大学环境研究院姜威教授课题组在 WILEY 出版社旗下的纳米材料领域旗舰期刊 Small （中科院一区 TOP/JCR Q1 ， IF=15.153 ）上发表题为 “2D MoS 2 Nanosheets Induce Ferroptosis by Promoting NCOA4-Dependent Ferritinophagy and Inhibiting Ferroportin” 的研究论文（ DOI. 10.1002/smll.202208063 ），被精选为当期 Frontispiece （扉页论文）高亮推荐。该研究首次报道了 2D MoS 2 纳米片通过促进 NCOA4 依赖的铁蛋白过度自噬和铁外排蛋白抑制从而导致细胞铁死亡的分子机制，这对于阐明二维纳米颗粒的毒性机制和确定其医学应用具有重要意义 。
引言
随着科学技术的飞速发展，不断要求具有优异性能的纳米材料。二维过渡金属二硫族化物 (2D TMDCs) 具有独特的物理化学性质，可以作为润滑剂、催化和储能材料以及药物递送载体等。 MoS 2 是一种典型的 TMDC ，由一层钼和两侧的硫层结合而成。作为后石墨烯时代的二维材料， MoS 2 独特而优异的性能使其具有广泛的应用前景，特别是在药物传递、基因传递、光疗、联合治疗、生物成像、治疗学和生物传感等生物医学领域。在这些应用中， MoS 2 纳米片主要作为载体或佐剂，这也增加了其在人体内的暴露和积累。随着 MoS 2 纳米片生产和应用的增加，其可能会带来多种途径的人体暴露。目前已知 MoS 2 纳米片暴露后可诱导细胞死亡、炎症反应和自噬扰动等。然而， MoS 2 纳米片在体内的生物活性和毒性机制尚不清楚 。
铁死亡是一种近年来定义的依赖铁的程序性细胞死亡模式，是细胞内 Fe 2+ 以芬顿反应方式氧化细胞膜上高表达的多不饱和脂肪酸从而引发脂质过氧化所致，同时伴随着膜脂修复酶谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4) 的失效。铁死亡与许多人类疾病密切相关，然而，人们对 MoS 2 纳米片暴露后是否引起铁死亡及其分子机制尚不清楚。为了解决上述问题，课题组选择肺上皮细胞系 BEAS-2B 和参与免疫防御调节的单核巨噬细胞 RAW264.7 作为体外模型。同时还建立了小鼠 MoS 2 纳米片吸入暴露模型。研究结果证实了 MoS 2 纳米片在体内和体外诱导铁死亡，并且铁死亡是由 MoS 2 纳米片本身而不是溶解离子引起的。细胞暴露于 MoS 2 纳米片后，大多数 MoS 2 纳米片通过巨胞饮作用进入细胞并定位于溶酶体，导致溶酶体膜通透性 (LMP) 增加。同时，核受体共激活因子 4 (NCOA4) 依赖的铁蛋白自噬被过度激活，铁蛋白在溶酶体中被降解，释放出大量 Fe 2+ ，由于 LMP 增加 Fe 2+ 渗漏到细胞质中，最终导致铁死亡。此外，铁外排蛋白 (FPN) 是目前唯一已知的细胞铁输出蛋白， MoS 2 纳米片暴露后对其表达水平的抑制进一步促进了细胞中 Fe 2+ 的过载，从而加剧细胞铁死亡。在体内模型中还观察到，暴露于 MoS 2 纳米片的小鼠肺部组织中的铁死亡水平增加，并且在小鼠肺组织中检测到过度的铁蛋白自噬和铁外排蛋白抑制，进一步印证了体外实验的结果。该研究强调了 2D MoS 2 纳米暴露通过铁蛋白过度自噬和铁外排蛋白抑制引发细胞铁死亡的新机制 。
图文导读
2D MoS 2 表征
MoS
2
纳米片在体内和体外引发铁死亡
MoS 2 纳米片暴露于细胞后，使用脂质过氧化传感器 BODIPY 581/591 C11 检测到脂质过氧化的积累，这是铁死亡的核心指标 ( 图 2A) 。 GPX4 是铁亡的关键调控因子，能够清除脂质过氧化，保护细胞免受铁亡的威胁。免疫印迹结果显示， MoS 2 纳米片暴露可下调 GPX4 蛋白水平 ( 图 2B) 。细胞 Fe 2+ 荧光探针也指示细胞内 Fe 2+ 水平显著增加 ( 图 2C) 。在 MoS 2 纳米片喉部滴注暴露小鼠模型中，观察到小鼠肺组织中出现支气管壁损伤和免疫细胞浸润 ( 图 2D) ，同时小鼠肺组织的 GPX4 蛋白质水平显著下降、脂质过氧化水平和铁离子水平显著上升 ( 图 2E-G) ，这进一步证实了 MoS 2 纳米片在体内也能引发铁死亡。此外，在 MoS 2 纳米片背景溶液 (BS) 暴露组中均为观察到铁死亡相关指标的变化。因此，研究结果证实了 MoS 2 纳米片能够引发铁死亡，且是纳米片本身而不是其溶解成分所导致的 。
MoS
2
纳米片通过巨胞饮进入细胞并定位在溶酶体中
纳米颗粒主要通过内吞作用被细胞内化，内吞作用包括巨胞饮、网格蛋白介导的内吞和小窝蛋白介导的内吞等。为了确定 MoS 2 纳米片的内吞作用途径，首先使用内吞抑制剂阻断相应的内吞途径，再将 FITC-BSA 标记的 MoS 2 纳米片暴露于细胞。共聚焦显微镜和流式细胞仪检测的结果均显示，细胞松弛素 D(Cyto D) 显著抑制了 MoS 2 纳米片的内化，而其他内吞途径抑制剂的作用可以忽略不计 ( 图 3A,B) 。溶酶体是细胞内多种内吞途径的终点，因此我们使用溶酶体特异性荧光探针 Lyso-Tracker 标记溶酶体，观察 MoS 2 纳米片内化进入细胞后与溶酶体共定位。共聚焦显微镜的结果显示，内化的 MoS 2 纳米片主要定位在溶酶体中 ( 图 3C) 。
MoS 2 纳米片诱导的铁死亡需要 NCOA4 依赖的铁蛋白自噬激活
铁蛋白通过在细胞中储存铁在铁代谢中起核心作用。铁蛋白自噬是指铁蛋白的选择性自噬降解，需要选择性货物受体 NCOA4 的介导，铁蛋白自噬会释放出 Fe 2+ ， Fe 2+ 的过载是导致铁死亡的关键因素。我们推测细胞 Fe 2+ 过载是由 MoS 2 纳米片诱导的过度铁蛋白噬引所起的。免疫荧光染色结果显示， MoS 2 纳米片暴露可促进自噬体和铁蛋白的共定位 ( 图 4A) 。这表明铁蛋白选择性自噬增加。同时，免疫印迹结果显示， MoS 2 纳米片暴露增加了 LC3II/I 和 NCOA4 蛋白水平，并降低了 FTH 的蛋白质水平 ( 图 4B,C) 。为了证实自噬在 MoS 2 纳米片诱导的铁死亡中的作用，我们使用自噬抑制剂 3-MA 阻断了细胞的自噬。发现 3-MA 处理成功抑制了自噬激活，同时抑制了 MoS 2 纳米片诱导的 NCOA4 增加和 FTH 降低 ( 图 4B,C) 。我们进一步使用 siRNA 内源性敲除细胞的 NCOA4 ，在敲除 NCOA4 后， MoS 2 纳米片诱导的 FTH 蛋白质水平下降得以恢复 ( 图 4D,E) 。这些结果表明， MoS 2 纳米片暴露激活了 NCOA4 介导的铁蛋白自噬。我们还发现 3-MA 处理和 NCOA4 的敲低都抑制了 MoS 2 纳米片诱导的 Fe 2+ 水平的升高 ( 图 4F) 。自噬的最后阶段是自噬体与溶酶体融合从而降解其内容物，基于 MoS 2 纳米片的溶酶体定位，我们发现 MoS 2 纳米片暴露增加了溶酶体膜通透性 (LMP)( 图 4G) 。过度的铁蛋白自噬导致溶酶体中积累的 Fe 2+ 可能由于 LMP 的增加而渗漏到细胞质中。因此， MoS 2 纳米片诱导的 NCOA4 依赖的过度铁蛋白自噬是导致细胞 Fe 2+ 过载的关键因素，也是铁死亡所必需的 。
铁外排蛋白
FPN
参与
MoS
2
纳米片诱导的铁死亡
铁外排蛋白 FPN 是目前唯一已知的细胞铁输出蛋白，负责输出 Fe 2+ 以维持铁稳态。在 MoS 2 纳米片暴露后，以剂量依赖性的方式下调了 FPN 的蛋白质水平 ( 图 5A) 。为了研究 FPN 在 MoS 2 纳米片诱导的铁死亡中的作用，我们使用质粒外源过表达了 FPN( 图 5B) 。 FPN 的过表达可抵消 MoS 2 纳米片诱导的细胞死亡和 Fe 2+ 过载 ( 图 5C,D) 。此外，过表达 FPN 还缓解了 MoS 2 纳米片诱导的脂质过氧化水平增加和 GPX4 蛋白水平下降，表明铁死亡受到抑制 ( 图 5E-G) 。这些结果表明 FPN 的下调可能会抑制过载的 Fe 2+ 向细胞外输出，进一步造成细胞 Fe 2+ 超载，从而加剧铁死亡 。
小结
研究成果提出了 2D MoS 2 纳米片的毒性新机制，为 MoS 2 纳米片的健康风险评估、安全生产和应用提供了理论依据。此外， MoS 2 纳米片通过诱导细胞 Fe 2+ 过载的特性可与传统抑制脂质过氧化的小分子抗癌药物协同作用，有助于开发新的诱导肿瘤细胞铁死亡的药物和抗肿瘤治疗方案，具有潜在应用前景 。
本研究工作得到了国家自然科学基金、山东省自然科学基金的支持 。
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