液相实战丨HPLC分析方法的建立
液相实战丨HPLC分析方法的建立
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上周，我们“分不开怎么办”栏目收到了一位王同学的咨询，她在 人参皂苷类化合物分析 方面遇到了一些困难：
1. 使用T家C18柱，Rg1和Re未实现基线分离（分离度R<1.5）；
2. 更换色谱柱为A家C18，在相同条件下，同样未实现Rg1和Re的基线分离；
3. 在A家C18色谱柱的基础上，调整流动相梯度，Rg1和Re可以满足基线分离，但是其他人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc和Rd）分离不理想。
王同学的诉求是 寻找一个合适的HPLC分析方法（包括色谱柱和流动相），能够实现样品中所有人参皂苷的良好分离 （ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1）。
收到问题后，我们的“大师兄”团队立即联系了王同学，针对她的诉求提出了一些建议。
王同学的这个案例很有代表性，因此今天我们就以这个案例为例，和大家 分享一下在做HPLC分析方法开发时的思路和心得 。
通常来说，建立合适的HPLC分析方法，你需要：
确定分离目标，明确方法要求；
解析目标分析物，包括化合物结构、分子量、吸收光谱、pKa和化学稳定性等方面信息；
对收集到的信息进行综合分析和考虑，选择合适的色谱柱（固定相），设计合适的实验条件；
使用挑选的色谱柱和实验条件进行分析，根据结果调整色谱柱和实验条件；
在合适的色谱柱和实验条件下，进行相关验证，最终得到稳定靠谱的实验方法。
针对今天的案例，我们一条条看：
首先，我们明确这个实验的目的是通过合适的 HPLC方法 实现 人参皂苷化合物 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1 的分离 。
建立合适的人参皂苷HPLC分析方法，需要进行全方位的考虑，其中 化合物结构 是至关重要的点。
人参皂苷（ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等 ）是人参的主要成分，都具有相似的基本结构： 含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。
它们都具备以下特点：
1. 化合物 偏中性 ，具备一定的 疏水性 ；
2. 不同化合物之间的差异在于糖分子的种类和数量， 结构比较接近 ，甚至属于同分异构体；
3. 分子量在800-1200， 分子结构偏大 （小分子领域）。
根据人参皂苷化合物的这些特点，我们确定了建立HPLC方法的要点：
1. 偏中性化合物， 流动相 可以采用非缓冲的 水溶液 ，甚至纯水相；
2. 具备一定疏水性的结构相近化合物，色谱柱考虑采用 C18固定相 ，使用 等度或缓梯度 ；
3. 分子物理尺寸偏大， 孔径 在分离中有可能发挥重要作用，需要仔细考察此点。
2020版中国药典人参的含量测定项规定的色谱柱： 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 。
但是中国药典方法中并没有明确色谱柱的细节，包括色谱柱规格、固定相粒径和孔径，而这些往往会影响分离效果。
我们先按照该方法，使用相同规格的不同孔径ChromCore 120 C18（120 Å）和ChromCore C18 （180 Å）对人参皂苷Rg1和Re进行分析，得到如下结果：
点击查看大图
在药典人参方法下，人参皂苷Rg1和Re在ChromCore 120 C18（120 Å）和ChromCore C18 （180 Å）上都能获得良好的峰型，在ChromCore C18 （180 Å）获得更好的分离度（R>2.0），满足药典要求。
ChromCore 120 C18（120 Å）和ChromCore C18 （180 Å）两款色谱柱采用相同的硅胶基质和键合工艺， 主要差别在于孔径 。
另外，2020版中国药典西洋参的含量测定项规定的色谱柱： 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 。
我们再按照该方法，使用相同规格的不同孔径ChromCore C18（180 Å）和ChromCore 300 C18 （300 Å）对人参皂苷Rg1和Re进行分析（两种人参皂苷在ChromCore 120 C18上共流出，谱图未放）：
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在药典西洋参方法下，人参皂苷Rg1和Re在ChromCore C18（180 Å）未获得基线分离，而在ChromCore 300 C18 （300 Å）获得更好的分离度，完全满足药典要求。
西洋参方法中梯度斜率高于人参方法（梯度更陡），因此人参方法适用的ChromCore C18（180 Å）在西洋参方法下，无法实现Rg1和Re的基线分离。
由此可见，在分离分子 尺寸较大且结构相似 的化合物时，不仅要选用合适的固定相官能团，更要 注意固定相基质孔径的选择 ，以达到最佳的分离效果。
经过上面实验的对比，最后我们选用ChromCore 300 C18 （300 Å），在中国药典人参方法下，对7种人参皂苷进行分析：
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由以上谱图可知，7种人参皂苷在ChromCore 300 C18 （300 Å）上都能获得良好的峰型和分离，完全满足HPLC定性和定量要求。
也就是说，在人参皂苷等 物理尺寸较大 的化合物HPLC分析中， 大孔径固定相色谱柱有利于结构相近组分的分离 。
希望今天这个案例的梳理，能够对你的HPLC分析方法开发工作有所启发和帮助。
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