为什么用国标方法检测食品添加剂时，峰总是飘来飘去的？
为什么用国标方法检测食品添加剂时，峰总是飘来飘去的？
chromclass
简明、有趣的教程，帮你学习更多科学仪器的原理、操作和维护知识。我们拒绝无趣、拒绝无聊：） 发送"目录"，获取更多色谱学堂文章列表。
色谱学堂 “分不开怎么办” 免费咨询活动 正在进行中
如果同学们在日常工作中遇到
方法开发或者仪器的软硬件问题
都可以扫描求助我们的“大师兄”专家团队
我们会尽力帮你解决
最近，有一位王同学在 对食品添加剂进行检测时 遇到了一些问题，来向“大师兄”求助：
1. GB 5009.28-2016 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定
2. GB 5009.121-2016 食品中脱氢乙酸的测定
1. 分析方法不稳定，山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠保留时间和分离选择性总是飘来飘去
2. 两个国标方法测定四种物质，有点繁琐
3. 安赛蜜也是需要测定的食品添加剂，可以一起分析吗？
我们先来温习一下液相色谱方法开发的几个步骤：
确定分离目标，明确方法要求；
解析目标分析物，包括化合物结构、分子量、吸收光谱、pKa和化学稳定性等方面信息；
根据目标分析的物理化学特性，选择合适的色谱柱（固定相），设计相应的实验方案；
使用挑选的色谱柱和实验方案进行方法开发和优化，初步建立色谱方法；
对建立的色谱方法进行相关验证，最终得到稳定靠谱的实验方法。
接下来，我们就跟着这个思路一步一步来解题吧：
用等度条件基线分离包括 安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠 和 脱氢乙酸 在内的五种常见食品添加剂。
1. GB 5009.28-2016 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定
2. GB 5009.121-2016 食品中脱氢乙酸的测定
流动相均采用 醋酸铵溶液 /甲醇体系 ，且 未规定醋酸铵溶液pH值 。
解析目标分析物，包括化合物结构、分子量、吸收光谱、pKa和化学稳定性等方面信息，根据目标分析的物理化学特性，选择合适的色谱柱（固定相），设计相应的实验方案。
-
从目标分析物的结构来看，五种物质的 亲水性比较强 ，并且大都是容易在水中离解的 酸性化合物 。
图1. 左右滑动查看图片
-
基于以上信息，首选 耐水型的C18色谱柱 ，流动相应为 高水相 的缓冲体系。有机溶剂比例和pH有待探索。
对比一下目前的国标方法：
-
C18色谱柱 ：没什么大问题
-
醋酸铵溶液/甲醇体系 ，也可以 ……. 嗯？？？？？
醋酸铵溶液，不控制pH值？！
有问题！
接下来，我们需要对现国标方法进行一番考察：
"
测试一： 同一根色谱柱，不同醋酸铵的来源
图2. 点击查看大图
我们可以看到，不同醋酸铵的来源，流动相pH有差异，导致分离不稳定。
"
测试二： 同一根色谱柱，同一来源，但不同批次的醋酸铵
图3. 点击查看大图
结果依然是流动相pH有差异，导致分离不稳定。
"
测试三： 同一根色谱柱，去离子水的批次或来源不同
得出的结果仍然是流动相pH有差异，分离不稳定。
通过这三个测试，我们得出一个结论： 必须严格控制流动相的pH以保证分离方法的稳定性。
使用挑选的色谱柱和实验方案进行方法开发和优化，初步建立色谱方法
我们用醋酸铵体系进行pH研究（5、6和7），发现保留时间和分离选择性受流动相pH影响很大：
图4. 分离选择性与醋酸铵溶液pH相关性显著
在pH=5时，虽然五种物质都可以达到基线分离，但脱氧乙酸的保留时间长达110分钟；
而在pH=7左右，可以达到基线分离，而分析时间也控制在20min以内。
考虑到分析通量，我们进一步选择pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5考察研究。
图5. 不同pH醋酸铵溶液对分离的影响
从上面的谱图我们可以看到：
pH7.5，山梨酸和脱氢乙酸保留时间接近；
-
pH7和pH6.5，5种添加剂可以得到良好的分离，总分析时间在20min左右，但分离选择性不同；
pH6， 5种添加剂可以得到良好的分离，总分析时间超过30min。
至此，我们知道对这类食品添加剂的分离时， pH的控制很重要 。
在使用国标所推荐的流动相体系（乙酸铵溶液/甲醇）时，pH需要控制在7.0 或者6.5附近，此时分离效果和分析时间都比较合适。
真的吗？！
我们还需要注意，醋酸-醋酸铵体系的缓冲范围为3.7-5.7，而所得到的最佳分离条件的pH6.5和pH7.0， 超出醋酸-醋酸铵缓冲范围 ，还是会导致山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠等保留时间和分离选择性的不稳定，所以 需要选择更合适的缓冲盐体系 。
磷酸盐 作为最常用的缓冲盐，其一段缓冲范围在 6.0-8.0 ，无疑是非常合适的选择。
因此用磷酸盐在其缓冲范围内考察在不同pH条件下的分离结果：
图5. 不同pH磷酸盐溶液对分离的影响
我们发现用乙酸铵体系得到的最佳pH7.0 和6.5基本可以在磷酸盐体系重现：
pH7.0，基线分离，分析时间在20min以内；
pH6.4，基线分离但分离选择性不同，分析时间在20min以内；
pH6.2，基线分离，分离选择性与pH6.4相同，但分析时间较长。
鉴于脱氧乙酸受pH的影响最大，为最大限度地保证分离选择性的稳定性和分离效果，在使用磷酸盐缓冲体系时，建议在 pH6.2 – 6.5范围内 探索最佳pH。
从下图可以看出，方法的重复性和标准曲线还是不错的
表1：重复性：95/5 v/v 20 mM磷酸盐缓冲液 (pH6.4)/甲醇-连续10针的结果
左右滑动查看更多
图6. 95/5 v/v 20 mM磷酸盐缓冲液 (pH6.4)/甲醇-标准曲线
这次我们用国标方法分析食品添加剂为例，说明以下几点：
-
在色谱方法开发中，除了要选择合适的固定相（色谱柱）， 流动相选择 也非常重要；
-
对于在水相里可以离解的目标分析物，流动相需要含有缓冲盐， 并且，流动相的pH应该在该缓冲盐的缓冲范围内 。
此外，也跟同学们分享了食品添加剂分离测试的窍门，希望对同学们的工作有所帮助。
如果你在分析实验中也遇到了方法开发方面的问题，欢迎来 咨询我们的“大师兄”团队 ，我们会尽力帮你答疑解惑。
我们目前支持大部分 主流品牌、常见配置的 液相色谱和气相色谱。
我们也会不定期地把咨询过程中碰到的具有 典型意义的案例 通过微信公众号来 跟大家分享， 与同学们一起提高、共同进步。
如果最后你的问题被我们选为典型案例分享 你还可以获得一份精美的 色谱学堂纪念品 哦~
最后，希望我们的免费咨询活动能够真的帮你解决工作中的问题，也希望大家能够 多多帮忙转发 ，让更多人看到我们的活动。