生物制药过程中常见疑问权威解读汇总

摇瓶传代时，P2用的A品牌摇瓶，P3用的是B品牌摇瓶，有什么影响，或者法律法规对这方面有什么说明指导？

对于生产中使用的关键耗材应该固定不可以随便更换，如果要更换需启动变更流程， 法规不会规定你 使用哪个品牌的耗材的。

单克隆抗体的原液解冻是在哪里以什么样的方式进行操作的？

（在制剂生产前）一般原液都是冷冻低温保存的，解冻之后才能将若干袋原液进行混合过滤。

可以在前期研发时做冻融实验 。 看情况，不是很着急的就放到2-8度冰箱里缓慢解冻，比较着急用就常温水冲弄过几种自身很容易降解的蛋白，但是也没因为解冻而降解的 。 目前使用的是25摄氏度饮用水解冻，据说容易降解，现打算采用摇床解冻 。

公司生产注射用重组蛋白类生物药（CHO细胞）一般其原液的生产过程都是从细胞复苏--细胞培养、扩增--分离纯化---原液检定，整个周期一般需要40天左右，是否可以在保证传代次数不超过规定的前提下，将培养扩增后的细胞作为下一批原液的种子细胞，缩短生产周期呢？

首先是必须按照申报的工艺进行生产，不复苏细胞是重大变更，如果想这么做，得做工艺验证，产品稳定性试验，再申报变更，国家局批准后生产。这个周期很长，一般不会由厂家这么做。再者不复苏细胞的话，不能保证每次培养细胞的生长特性一致，造成收率不一致，很影响产品质量和效益。

统一复苏一批，一起冻了，要用的时候拿一只出来扩增，扩增的步骤也一样，保证原料起始一致，该冻起来的种子也是经过中检所验证的，那么当然是比较好，不然的话，每天上罐的时候代次是不一样的，也就不是同一株细胞，无法保证上罐之后细胞质量一致~

菌种长期储存会使活力下降，但对于长期储存的菌种，尤其是基因工程菌来说，活化后还可恢复原来的活力吗？

氮保存两年内，超低温保存一年内，如果冻存步骤恰当，复苏之后活力应该在 95%以上。

不同产品的纯化应当分别使用专用的层析分离柱。不同批次之间，应当对层析分离柱进行清洁或灭菌。 不得将同一层析分离柱用于生产的不同阶段。应当明确规定层析分离柱的合格标准、清洁或灭菌方法及使用寿命。层析分离柱的保存和再生应当经过验证。

这个分离柱的寿命，如何确定？

主要是指填料。阴阳离子、亲和，填料是有一定寿命的，吸附能力会逐步下降，就当清洁验证那么做就可以了。最主要的标准就是洗脱效果、回收率什么的，自己定个标准，规定警戒线换填料。

这个验证一般填料供应商会做的。 柱效就是柱子的效果，可以测试一下吸附能力 很简单，用一定浓度的标准溶液过一遍柱子，看看填料吸附量多少，是否符合标准，能否起到过滤的作用。 另外用缓冲液冲洗柱子，检测流出。

生产用种子批、细胞库应当在规定的贮存条件下在不同地点分别保存，避免丢失。

除避免丢失外，更主要是防止意外导致的种子活性降低、死亡等，所以，原始种子库、主种子分开存放，单纯低温冰柜是不够的，原始种子库还应于液氮中备份保存。工作种子库可直接放车间，不备份可以，备份更好。管理上，双人双锁是最基本的，还应有监控、记录、报警等措施，包括冰柜温度异常等。液氮中保存还应有液氮量的监控。

同一超滤器能否用于同一产品的不同阶段

第一选择：有条件的话最好分开用；第二选择：退而求其次设备共用，但是滤芯或膜包分开专用。不认同全套共用。

滤膜、填料的结构及生物制品成分的复杂性决定了清洁验证的效果很难保持长期一致性，你可能持续十几个同样的清洁程序都没有杂质检出，但是一用到工艺上随着条件的改变、甚至受到你的产品本身的影响，原来吸附的杂质就下来了。清洁验证所检的项目都是已知的，但是生产过程中引入的未知的微量的有生物活性的成分说不清，不可能都考虑到。想想GMP为什么用平整、光滑、易清洁等规定。

有些问题是实践出来的。柱层析本身即使你做了清洁验证。实际情况也是放置一段时间后还在释放吸附物。超滤本身是分子截留。情况会好一些。相对风险低。所以，一楼建议你不要使用同一个膜包。从认证角度说，你重复用在不同工序，会被现场质疑的。从科学性角度说，我觉得可以考虑在低风险工序，或者说不要用于最后一个超滤工艺步骤。

发酵时使用的原材料（用于配制培养基，例如一些无机盐等），进厂全检后是否需要留样； 分离纯化用到的有机溶剂，进厂全检后是否需要留样；

无论是发酵的原材料还是分离纯化的原材料，你都可以进行是否是关键物料的评估，评估为关键物料的，肯定需要进厂的每批进行全检，非关键物料的可以定期全检，每批检测重点项目（如鉴别，含量等），至于留样，在关键物料评估后如是关键物料，可根据物料是否易保存的性质进行评估选择性留样，非关键物料可以不用留样吧。 GMP规定物料的留样主要是针对制剂的原辅材。

进口原辅料应当符合国家相关的进口管理规定。具体的要求有哪些呢？

1.境内外上市制剂中未使用过的药包材、药用辅料，应进行关联申报或由药品注册申请人按照 2016年第155 号通告要求一并提交全部研究资料；如果已经使用的，在报产的时候关联。

2、现行版《中国药典》已收载的，应符合现行版《中国药典》要求；现行版《中国药典》 未收载的，应符合国家食品标准或现行版USP/NF、EP、BP、JP 药典标准要求；其他辅料， 应符合药用要求。

3、辅料的合法来源证明文件，包括辅料的批准证明文件（含有效的药用辅料注册证、 核准编号或实行关联审批的药用辅料《受理通知书》等）、标准、检验报告、辅料生产 企业的营业执照、《药品生产许可证》、销售发票、供货协议等的复印件。

细胞培养和细胞纯化阶段的设备应该检测哪些项目，限度又该怎么定？

可降解蛋白质产品，可以通过清洁的最终淋洗水和罐、管内壁的TOC含量表示蛋白质请清除程度。细胞和纯化的不锈钢容器清洁，因为是原液制备，不同于制剂配制罐，可以通过面积和最低反应日计量来计算具体的含量，所以一般规定淋洗水1～2ppm，表面1～2ppm/25cm2即可，如果最终淋洗水是注射用水，其pH，电导率，内毒素、微生物接近注射用水水质可以被认为清洁良好。

如何把细胞养的更漂亮？

1. 不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。

2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。)如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！

3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。

4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。

单抗中吐温80的作用是什么？

表面活性剂，稳定蛋白的作用，不稳定的蛋白表面张力很容易让蛋白聚集，TW80可隔绝气液界面，改变张力，从而保护蛋白。

制剂部分，主要是增溶！

吐温80在单抗制剂中是起稳定剂作用，防止蛋白质溶液出现团聚、沉淀。

请问病毒灭活如何验证？目前使用的121度蒸汽灭菌，但是灭菌后蛋白变性很难清洗，想改为生产完后消毒剂灭活，请问如何验证？

121  ℃ 是灭菌，病毒灭活不需要那么高的温度，病毒灭活温度，60~80 ℃ 就可以灭活了。

温度验证，当然不能用真是的病毒来做，需要找到类似的模拟物，用模拟物代替病毒进行温度验证。

细胞培养用的培养基是否要作为关键物料？

培养基的好坏会直接影响细胞的生长，进而影响生产工艺的稳定，肯定算是关键物料。

辅料是可以最终制剂中存在的，原材料是可以过程去除的。

制剂中的一种辅料厂家生产地址发生变更，制剂需做哪些工作

如果稳定性结果与之前有差距，说明原料工艺发生了变化，估计你要重新评估了，首先是了解辅料工艺情况，其次辅料的相容性，然后是稳定性考察

细胞生物制品做无菌检验，可以用上清做吗？还是要用原液做？

就样品的代表性而言，上清液不能代替原液

生物制剂冷链运输中的控温漏洞，如何解决？

大家都知道生物制剂如疫苗及血液用品冷链运输的重要性。目前国内也通过各种政策不断增强对冷链运输及冷库各环节的安全监管。可是在冷链运输过程中，即使使用监控设备，仍然有很多风险和漏洞，如：

1.监控设备断电失联；

2.检测数据后台可更改；

3.中转装卸过程中不受监控，有超温风险；

4.电子监控设备乘飞机受限另外，产品在接收点/使用点处无法实现单品温度监控、缺少电子监控设备，这部分也同样存在风险点而作为消费者，更是无法从产品外观上直观了解产品运输的控温情况，造成消费者对产品质量的顾虑和不信任......国内最新包装的宫颈癌九价疫苗的 内包装（塑料膜）上都贴了编号为“30China”的疫苗热稳定标签（HEAT marker）。这意味着宫颈癌九价疫苗在37℃的环境下存放30天后还能继续使用。疫苗热稳定标签是一个铜钱形状的贴纸，外围圆圈部分为紫色，内部为白色正方形，标签会随着温度变化而变色，若标签白色部分逐渐变成紫色或者更深的颜色，表明温度已经超出疫苗可承受的高温暴露范围，该疫苗必须报废。能够让消费者更加直观地辨别疫苗是否可以接种。

药品生产用洁净压缩空气的质量控制。

1.  压缩空气在制药领域的应用 压缩空气在药品的生产过程中的应用十分广泛，如 菌苗类大罐发酵工艺、疫苗类半成品配制、原液及配液混合稀释罐使用、 物料的转移和吹扫、工艺系统灭菌后的保压， 以及气动式元件的控制 等。由于与药品生产直接接触的压缩空气的品质直接影响了产品质量的好坏，因此，为了保证压缩空气的品质，除了对压缩空气采取严格的净化处理，还需要控制压缩空气的含油量和含水量。

2.压缩空气系统

2.1  洁净压缩空气系统的组成 压缩空气及净化系统一般由产生、处理和储存压缩空气的设备所组成的系统称气源系统，也称为空气压缩系统。 压缩空气系统从功能上可以分成以下几部分：

1)产生压缩空气的部分：如空气压缩机及其控制系统、 冷却水系统等；

2)处理压缩空气部分：如干燥机、过滤器、除油器等；

3)输送压缩空气部分：如储气罐、管路、阀门等

2.2洁净压缩空气系统的工作原理空气在压缩 和输送等过程不可避免 地与机器部件接触，因此，空气压缩机输出的压缩空气中可能含有大量有害杂质，包括水、水雾、水蒸汽、凝结水；油，包括油雾、油蒸汽；各种固态物质，如锈泥、金属粉末、橡胶细末、焦油粒及滤材、密封材料的细末等；还有各种有害的化学异味物质等。 不通过适当的方法清除，不但会对气源系统造成危害，还会在实际运用造成以下不利的影响：

1)压缩空气中的微生物和粒子会造成无菌产品的污染；

2)混合在压缩空气中的油蒸汽聚集到一定程度就会 形成易爆易燃源，而润滑油汽化后会形成一种有机酸，容易腐蚀压缩空气管道内表面以及气动元件；

3)混入的微小颗粒（如尘埃、铁锈等），极易损坏气动元件，堵塞节流孔，更加严重的是极易对物料造成严重的污染；

4)混合在压缩空气中的水分，在一定的温度压力下就会饱和析出水滴， 当压缩空气与物料接触时，极易对物料的质量造成严重的影响；

5) 压缩空气温度过高及产生水，对疫苗类及菌苗类生产有绝对性的危害。

3.洁净压缩空气质量标准

3.1 压缩空气质量等级标准 为了统一标准，国际标准 组织（ISO）所属 空气压缩机、气动机械及工具委员会（TC118）在 1986 年提出了关于压缩空气干燥净化设备和压缩空气品质的国际标准 ， 其中压缩空气质量等级标准ISO8573.1 把压缩空气中的污染物分为固体杂 质、水和油三种（我国等同采用了 ISO8573即国家标准GB/T13277－91《一般用压缩空气质量等级》）。

2001年ISO 标准组织对 ISO8573.1 进行修改， 其主要变化表现在对固体颗粒的要求上。新标准对固体颗粒的数量进行了规定，这一变化是结合了纤维过滤器的实际性能，而且比较容易检测，具体见表 1 2.2洁净压缩空气企业质量标准 目前，用于药品生产的洁净压缩空气还没有正式的国际或国家的质量标准，参考上述质量等级标准及 GMP  对空气洁净度的要求，通过对上述质量的综合评估并结合企业实际需求和检测方法，制定了企业洁净压缩空气的质量标准。

4.药品生产用压缩空气质量检测 压缩空气的检测主要包括： 粒 子数、微 生物数、含油量、含水量

4.1洁净压缩空气含油量的检测以德 国 ，德尔格DragerAerotest Simulan为例，将测量装置连接到需检测的洁净压缩空气用气口上，缓慢打开气体阀门，对测量装置进行冲洗2～3min，用切管器将标有“OilVapour”的水含量检测管的两头切开，将油含量检测管插入测量装置上标有“Oil”的支撑管中，计时 5min 后，从测量装置上取下检测管，打开保护膜，等待 1min，根据指示层的变色情况判断油含量。若气体中油含量＜0.1mg/m3为合格。

4.2洁净压缩空气含水量的检测同油检测方法，用切管器将标有“WaterVapour”的水含量检测管的两头切开，将水含量检测管插入测量装置上标有“H2O”的支撑管中，计时 10min 后，从测量装置上取下检测管，根据指示层的变色情况来判断气体中水的含量。若气体中的水含量＜100mg/m3为合格。

4.3微生物的检测采用空气浮游菌采样器，通过收集悬浮在空气中的生物粒子 1000L 于大豆蛋白琼脂培养皿上，先经 20~25℃培养 72h，再经 30~35℃培养 48h，让其繁殖到可见的菌落数后进行计数，每个测点的浮游菌浓度必须低于 1cfu/m3 。

以上是推荐的后处理流程图 因此，对于压缩空气在制药应用方面是没有确定性的，在不同的生产工艺所要求的气体品质也是不一样的，但是必须保证最低标准目前，药品安全仍然是不容忽视的问题。 制药行业压缩空气对药品质量有极其重要的作用，对目前广泛存在于设计、施工和使用管理方面的许多问题，应引起有关部门的高度重视，根据各个环节的实际情况，逐步对其行为加以规范。 并且，随着自动化水平的提高和无人化操作的实现，必将消除压缩空气最大的污染源，也可从根本上保证洁净室的无菌效果。 此外，药品生产过程中压缩空气系统进一步优化，对其进行高效洁净改造，提高其运行效率，将成为一个重要工作，这具有巨大的经济效益与社会效益

生物制品对不锈钢材质的要求 

高氯浓度等都可能腐蚀不锈钢，哪怕是316L；所以应考虑降低接触时间或选取其它材质（不锈钢镀膜等）；对于接触高氯体系等情况，不锈钢也比较难在验证/确认时评估通过。

看你是配液还是储液，配液接触时间端短，一般盐溶液浓度不是很高的话，316L能够承受，好一点用904L。储液的话接触时间较长，用254或者2507。最好的就是钛材了，但是这玩意造假特贵，或者选用镀钛可能便宜一些。