科研 | npj Parkinson’s Disease（IF：8.651）：帕金森病与粪便真核微生物群之间的关联

点击蓝字↑↑↑“微生态”，轻松关注不迷路

生科云网址： https://www.bioincloud.tech

编译：微科盟煎蛋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载 ，转载须注明来源《微生态》公众号 。

总共有18个（53%）的PD患者样本（6名女性和12名男性）和18个（72%）的对照组样本（10名女性和8名男性）产生了足够的18S rRNA 基因扩增子用于下游应用。测序数据集包含经过质量控制、去噪、双端合并和嵌合体去除后的493979个部分18S rRNA基因序列。每个样本的平均序列数为13350（最少：3895；最多：23080）。 根据SILVA提供的7个分类级进行分类学分配，其中第6级为属，第5级主要为科，第4级主要为目，等等。将每个样本的序列提纯至均匀深度后，确定了1612个扩增序列变异(ASV)，隶属于SILVA数据库中的122个属量级，95个科量级和24个目量级 。ASV稀疏曲线（图1）表明测序深度足以检测所有样品中的绝大多数分类群。

图1. α稀疏曲线可显示真核生物丰富度和测序深度的依赖性。显示的是所有样本测序样本深度的扩增子序列变异 (ASV) 丰富度稀疏曲线。蓝色：PD 样品，橙色：对照。线条代表 50 个采样步骤的平均值，每个步骤的不透明轮廓作为标准误差。

PD患者真核微生物的3个α-多样性指数Observed, Shannon和Simpson（图2a）显著低于对照（CTRL）（ p _{O bserved}  <0.002， p _Shannon  < 0.001， p _{Si mpson}  < 0.002)。

使用了不同组的非参数多元方差分析（ADONIS）（图2b，c）计算β多样性。 在PD和对照组之间，分数统一 (UniFrac) 测试揭示了加权 ( p _wUniFrac  = 0.0073) 和未加权 ( p _UniFrac < 0.0128) UniFrac 测试存在显著差异。对于未加权的UniFrac测试，经恩他卡朋（ p _UniFrac <0.0483）或左旋多巴（ p _UniFrac  <0.0051）治疗的PD患者与对照之间，以及未接受恩他卡朋（ p _UniFrac <0.0021）或左旋多巴（ p _UniFrac  <0.0068）治疗的PD患者与对照之间存在显著差异。 对于加权UniFrac测试，在未接受恩他卡朋治疗的 PD 患者与对照组（ p _wUniFrac < 0.0003）以及接受恩他卡朋治疗的 PD 患者（ p _wUniFrac < 0.0129）之间存在显著差异。对于药物左旋多巴，在对照组和未经治疗的PD 患者 ( p _wUniFrac < 0.0006) 和接受治疗的患者 ( p _wUniFrac < 0.0353)之间发现了β多样性存在显著差异。

图2. 根据对照组和 PD 患者之间的差异用于可视化真核生物群落结构α和β多样性的图。PD 样品为蓝色，对照样品为橙色。对于Observed、Shannon和Simpson三个最常用的α多样性指数显示在（a）中。α多样性箱线图由中位数和下四分位数和上四分位数组成，而胡须代表单个样本的最小和最大分布。组之间的显著差异用星号表示（*** p < 0.001，** p < 0.01）。加权 ( b ) 和未加权 ( c ) UniFrac 测试的 PCoA 图用来显示β多样性。在对照和 PD 之间β多样性显示出显著差异。

假设检验显示，使用SILVA数据库检测出PD患者和对照之间属等级上的七个分类群的相对丰度存在显著差异。 与对照组相比，PD患者 Aspergillus 属（ p _FDR <0.031）， Cercomonas （ p _FDR   <0.037）和 Heteromita （ p _FDR   <0.022 ） 以及3个未知属特征的轮藻门（ p _FDR   <0.019），色金藻目 ( p _FDR   < 0.013) 和Opisthokonta 界 ( p _FDR    < 0.013)相对丰度显著降低。 相比之下， 在PD患者组中隶属于地霉属的ASV ( p _FDR  < 0.017) 相对丰度显著高于对照。如表1所示，由美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的核苷酸数据库基于核苷酸的基本局部比对搜索工具（BLASTN）代表序列的分类揭示了这些功能不同的物种。该属白地霉、曲霉、尾滴虫属以及 Heteromita 被鉴定为分别与 Geotrichum candidum , Penicillium roqueforti , Paracercomonas  sp.以及 Cercozoa  sp. B134密切相关（序列同一性>99%）。在未知的Chromulinales 分类群下，发现了未知Charophyta分类群的 Linum usitatissimum 和 Poterioochromonas malhamensis 存在最高序列同一性 (97-99%)。没有发现与Opisthokonta同一性>90%的序列。

表1. PD 样品和对照之间的分类群存在显著差异。

图中显示了对照组(Ctrl)和帕金森病(PD)样本之间存在显著差异的类群，以及基于QIIME2 (SILVA)和NCBI数据库中SILVA数据库条目的代表性序列的注释。每个类群的平均相对丰度(abun.)、标准差(SD)和患病率也被显示。PD和对照样本之间的假设检验的P值与非配对和非正态分布样本的双面Wilcoxon Mann Whitney检验(P值Ctrl vs. PD)进行多重测试的错误发现校正(FDR)。NA未赋值。

使用非浓缩ASV表分析微生物组 (ANCOM-II)的组成，发现地霉的12 个 ASV在对照和 PD 患者之间存在显著差异（ W  > 0.8， p _FDR < 0.05）。使用BLASTN和NCBI 数据库将这些ASV 鉴定为白地霉（序列同一性>98.7%）。 然而，即使 W 截止值设为 0.6，ANCOM-II也没有发现其他ASV在PD患者和对照之间存在显著差异。

与粪便钙卫蛋白水平正常的对照组或PD患者( n= 12)相比，粪便钙卫蛋白水平升高的PD 患者( n=6) 样本显示群落组成没有显著差异。 接受左旋多巴药物治疗的PD患者（n=12）显示出较高的地霉属丰度（ p _FDR =0.0138） 。然而，没有接受左旋多巴治疗的PD患者与其正常对照或接受左旋多巴治疗的患者与对照之间没有显著差异（n=6）。 与对照组相比，使用恩卡他朋和左旋多巴治疗的PD患者(n=7) 也显示出 Geotrichum 的显著增加 ( p _FDR  = 0.0069)。 最后发现，接受恩他卡朋治疗的PD患者（n=11）与对照组之间，或未接受恩他卡朋治疗的PD患者与接受恩他卡朋治疗的PD患者之间没有显著差异。

在我们之前的研究中，使用Spearman rho和Pearson rho相关性分析，在地霉相关序列的计数数据与来自相同样本任何细菌属的计数数据之间没有观察到任何显著相关性。

许多科研人员希望通过qPCR或16S rRNA基因的扩增子不同区域测序、焦磷酸测序、离子激流以及Illumina MiSeq技术来揭示PD患者肠道微生物群的细菌的组成。然而，关于真核肠道微生物群与PD的关联和潜在功能影响知之甚少。最近，来自一组PD患者粪便样本的真菌特异性内部转录间隔区(ITS)-2扩增子测序未能揭示PD和对照组之间的相对丰度或多样性的任何遗传差异。作者还指出，其样品中真菌负荷非常低，而PD患者中真菌DNA量显著降低。 这一发现可能部分解释了为什么我们的样本中有28%（对照）和47%（PD）没有产生足够的扩增子用于下游分析 。然而，我们发现其余PD和对照样品之间几种真核生物分类群（包括真菌）的相对丰度存在显著差异。

我们的数据表明， 真核生物的Observed丰度、Simpon度和Shannon度（图显著降低 （图2a），这与Cirstea等人相反。研究中丰度未发生改变可能是由于样本组的差异，例如饮食习惯、地理起源或病史和环境状况。然而，我们的发现与先前被报道的细菌丰度下降相匹配。 β多样性测试还显示了未加权和加权 UniFrac度量的PD和对照样本之间的显著差异 （图2b，c)，表明 PD患者的真核微生物群与健康对照组之间的群落组成存在显著差异。 因此，我们的期望是发现几种分类群的相对丰度存在显著差异。

对于本研究队列的细菌群落，我们之前也报告了在PD样本中观察到的 α多样性显著降低。 然而，与此处提供的真核数据相比，假设分布均匀的指标（Shannon和Simpon）和所有β多样性参数并未显示出对照和PD患者之间的显著差异，表明 在PD中真核和原核生物多样性存在差异 。然而，这些差异也可能是由于此处分析的样本量较小或使用了不同的测序方法。

尽管我们发现了7个等价类群在对照样本和PD样本之间的相对丰度上存在显著差异，但在使用ANCOM-II时，仅发现地霉属存在显著差异。可以推测，观察到的其他少量丰度的消耗仅仅是由于PD样品中地霉的过度生长，而不是实际消耗。进一步的研究可能会揭示其他群体（例如原生动物）是否也存在显著差异。我们的数据至少表明， 除了像地霉这样的霉菌外，在PD患者和对照之间其他真核属也可能有所不同。 尽管食菌性滑翔动物鞭毛虫如 Cercomonas  ( Paracercomonas ) 、 Heteromita  ( Cercozoa  sp. B134) 和 Poterioochromonas 不是人类肠道微生物群的典型代表，但原生生物通常具有选择性，并且可能影响肠道细菌的病毒性、代谢和形态。青霉菌和曲霉菌普遍存在于健康人的肠道中。众所周知，霉菌会产生各种真菌毒素，并影响黏膜细胞因子的反应，从而影响胃肠道稳态和细菌肠道微生物的组成。

与其他属相比，Dipodascoaceae及其附属地霉属在PD样品中的相对丰度显著高于对照。Dipodascoaceae通常在人类粪便样本中发现，并有可能在肠道中定居。 很少有物种被认为是健康问题，并能够引起地霉病，包括产生几种毒素的地霉念珠菌。然而，该物种也用于乳制品生产，它也被认为是一种腐坏生物，会导致免疫功能低下的病人发生机会性感染。乳球菌噬菌体的丰度增加(乳球菌噬菌体也存在于乳制品中)，被认为是导致PD患者乳球菌缺失的原因。乳球菌噬菌体的丰度增加(乳球菌噬菌体也存在于乳制品中)被认为是导致PD患者乳球菌缺失的原因。联合我们的数据，这些观察结果表明 饮食习惯，尤其是乳制品，对PD 患者的肠道微生物群有特殊影响。 由此也可推测，PD患者比健康患者提供更适合该物种的肠道环境。由于地霉属在对照组和PD患者之间的相对丰度存在显著差异，我们使用它与我们之前发表的细菌16S rRNA基因数据进行相关性分析。然而，在错误发现率校正后，没有发现与任何细菌属显著相关，表明没有直接的真菌细菌关联。然而，技术原因(例如不同的测序技术)或研究之间的时间差距至少在一定程度上可以解释这些相关性缺失的原因。

显然由于丢弃样本，本研究相应的子样本规模较小，所以所有的假设都需要验证。此外， 尽管据报告欧洲饮食具有杂食性，有些发现可能是由于被调查患者的食物偏好不同造成 。显然需要进一步分析来验证观察到的群落组成差异是否与PD的生物学或医学机制相关。为此，需要使用18S rRNA基因序列和ITS 区域序列的多个可变区或宏基因组学方法进行更复杂的分析。由于人类肠道样本产生的宏基因组学序列中只有 0.01%可以与真菌基因组对齐，因此这种宏基因组学方法需要足够的测序深度。

本研究证明PD患者粪便样本真核微生物群落的多样性较低，并且在PD和对照粪便样本之间几种真核生物分类群的相对丰度存在差异，表明PD与真核微生物群之间存在关联。 在PD组中，我们特别观察到地霉的相对丰度非常高，这是一种常见于人类肠道中的真菌属，通常不被视为肠道病原体。 此外，检测到少数少量丰度组的差异。进一步的研究需要验证这些发现是否具有可重复性、功能相关性或诊断价值。尽管存在抽样问题（样本年龄、样本量小），但环境因素（例如所研究队列的地理和文化背景以及所使用的测序技术）可能会解释与先前研究的差异。显然，需要更大样本的研究，结合宏基因组学、宏转录组学或代谢组学方法，以更深入地了解肠道真核生物与PD之间的潜在联系。

微文推荐阅读

1. 土壤微生态文献包免费领取 | 150篇近两年高影响因子土壤微生态相关文章

2. 根际微生态文献包免费领取 | 60篇近两年高影响因子植物根际微生物相关文章

3. 肠道微生态文献包免费领取 | 100篇近两年高影响因子肠道菌群与消化道疾病相关文章

4. 元素循环微生态文献包免费领取 | 60篇近两年高影响因子植物-土壤碳氮磷相关文章

微生态公众号 长期接受科研文章投稿 ，若您有科研成果想要与更多老师分享交流，欢迎联系微科盟组学老师投稿，本公众号 免费刊登 。

微生态科研学术群期待与您 交流更多微生态科研问题

（ 联系您所添加的 任一微科盟组学老师即可 ，如未添加过微科盟组学老师，请联系多组学老师16， 无需 重复添加 ）。

了解更多菌群知识，请关注“微生态”。