一作解读丨中国农大（IF：16.806）：马曦教授团队最新研究设计出高稳定性自组装嵌合肽用于对抗仔猪细菌感染（国人佳作）
一作解读丨中国农大（IF：16.806）：马曦教授团队最新研究设计出高稳定性自组装嵌合肽用于对抗仔猪细菌感染（国人佳作）
Microeco2016
专注各种微生态的研究，主要采用的技术有菌群多样性测序，宏基因组测序，宏转录组测序，基因组测序，转录组测序，蛋白质组和代谢组相关技术。微生态会定期通过网络举行各种微生态研究技术的公益讲座，汇总微生态相关研究进展，解读微生态研究论文。
点击蓝字↑↑↑“微生态”，轻松关注不迷路
生科云网址： https://www.bioincloud.tech
编译：微科盟谭鹏，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载 ，转载须注明来源《微生态》公众号 。
2022年3月13日，中国农业大学马曦课题组在Advanced Science发表题为Designing Self-Assembling Chimeric Peptide Nanoparticles with High Stability for Combating Piglet Bacterial Infections的研究性论文。抗生素拯救了无数生命，因此被誉为20世纪最伟大的医学发明之一。然而，抗生素的频繁和不规则使用加速了细菌耐药性的发展。 SARS-CoV-2大流行导致所有抗生素的使用增加，进一步加剧了细菌耐药性的风险。 近年来，抗生素耐药性导致的多重耐药细菌危机一直困扰着人类健康和畜牧业。此外，中国政府已发布政策，从2020年7月1日起禁止在饲料和养殖中添加饲料抗生素，这导致饲料中抗生素替代品的需求显著增加。这就需要开发新的抗菌药物或抗生素替代品。
抗菌肽作为一种新型抗生素替代品，具有抗菌谱广、生物相容性高、低毒性等优点。 此外，与抗生素（选择性干扰细菌代谢的特定步骤）不同，大多数肽基抗菌药物通过物理破坏细菌的脂质双层发挥抗菌作用，这使得细菌难以产生耐药性。然而，大多数多肽类抗菌药物不稳定，易受阴离子物质干扰，在生理条件下易被蛋白酶降解；这严重限制了肽基抗菌药物的治疗效果。目前迫切需要可行的策略来克服肽类抗菌药物的药理学缺陷，提高其稳定性。
在该研究中，设计了一种 由C14烷基链，疏水区，正电荷区和聚乙二醇单元构成的嵌合嵌合肽，并将其应用于细菌感染的治疗 。体外研究表明，嵌合肽NPs1和NPs2具有广谱抗菌活性和理想的生物相容性，并在生理盐环境中保持其抗菌能力。嵌合肽NPs1和NPs2可以抵抗高浓度蛋白酶的降解。体内研究表明， 肽粒子NPs1和NPs2的毒性可以忽略不计，这些嵌合肽可以减轻小鼠和仔猪的全身细菌感染 。膜渗透机制和对细胞周期的干扰不同于抗生素，这意味着嵌合肽颗粒诱导耐药性的风险较低。总的来说，这些进展可能加速免疫抗菌肽材料的发展，为改善仔猪腹泻提供理论依据 。
论文ID
原 名： Designing Self-Assembling Chimeric Peptide Nanoparticles with High Stability for Combating Piglet Bacterial Infections
译 名 ： 设计高稳定性自组装嵌合肽用于对抗仔猪细菌感染
期刊 ： Advanced Science
IF： 16.806
发表时间： 2022.3.13
通讯作 者： 马曦
通讯作者单位： 中国农业大学动物科学技术学院
DOI号： 10.1002/advs.202105955
实验设计
结果与讨论
基于对肽类抗菌药物发挥抗菌活性的机制和自组装原理的理解，我们设计了一系列自组装嵌合肽纳米粒子。众所周知，足够的净电荷是肽发挥抗菌活性所需的物理和化学参数之一。在本文中， 单体肽中的正电荷数设置为六个，因为之前的研究表明超过六个电荷肽的抗菌活性将不再增加。还考虑了带正电荷的氨基酸的类型。 精氨酸（Arg）的胍侧链可以与两个脂质头基的磷酸部分产生强二齿氢键；这赋予肽更强的膜破坏能力，但也使肽的生物相容性和选择性丧失的可能性更大。此外，在稳定性方面，Arg比Lys更容易被胰蛋白酶识别和切割。因此，我们拒绝在序列中引入Arg，因为它违反了高细胞相容性和稳定性的设计原则。作为亲水性载体，PEG保留了肽类抗菌药物的生物学功能，减少它们的细胞毒性，并保护它们在复杂的生理环境中免受蛋白酶降解；因此，它经常被用作纳米材料中的辅助因子。电荷屏蔽效应是PEG提高纳米粒子细胞相容性的机制之一；因此，我们将其结合到肽链的不同位置，以探索位置对纳米粒子细胞相容性和稳定性的影响。PEG连接到肽纳米颗粒NPs1和NPs2的Lys侧链的氨基上。在NPs1中，PEG靠近肽链的疏水端，而在NPs2中，PEG远离肽链的疏水端。在NPs3中，PEG与肽链末端的脯氨酸相连。末端烷基链允许肽形成纳米颗粒，它们提供了纳米颗粒嵌入细菌膜所需的疏水性。值得注意的是， 疏水氨基酸的类型也会影响抗菌性能。芳香族氨基酸具有较高的膜界面亲和力，有利于肽类向膜内的渗透。 此外，苯丙氨酸倾向于诱导肽链自组装，将苯丙氨酸引入肽链骨架有助于提高超分子纳米组件的组装能力。同时，肽链中的所有天然氨基酸都受到Pro的保护，Pro具有特殊的吡咯环结构，可以减少体内蛋白酶对带正电荷和疏水氨基酸的识别和切割。根据反相高效液相色谱（RP-HPLC）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）结果， 通过标准固相肽合成技术制备肽两亲物（NPs1、NPs2和NPs3）。 肽的相对分子质量接近理论相对分子质量，其纯度超过95%，表明肽已成功合成（图1a-c；图S1-S3）。
研究方案1. a）嵌合肽两亲物自组装成纳米颗粒的示意图。b）肽纳米颗粒（具有优异的稳定性）通过膜破坏机制杀死细菌。将肽纳米颗粒腹膜内注射到仔猪体内以杀死细菌。LPS：脂多糖；OM：外膜；CM：细胞质膜。
嵌合肽的自组装行为由其临界胶束浓度（CMC）决定。因此，利用1-苯胺基-8-萘磺酸盐（ANS）荧光研究了嵌合肽的自组装能力和CMC。如图1d-f所示，当浓度增加时，两亲分子NPs1、NPs2和NPs3的ANS荧光强度增加，表明所有嵌合肽都可以形成超分子纳米结构。用两条直线拟合485 nm处不同肽浓度的荧光强度值，并用这些直线的交点来估计嵌合肽的CMC。如图1d-f所示，NPs1、NPs2和NPs3的CMC分别为10.72×10 -6 , 9.03 × 10 -6 和8.42×10 -6 M。这表明所有三个肽两亲分子都有很强的自组装能力。随后，为了便于寻找超分子结构，我们直接观察了CMC上方的两亲肽的纳米结构。透射电镜结果表明， 肽两亲物NPs1、NPs2和NPs3均形成直径为大约20-50 nm的纳米粒子，嵌合肽NPs1的粒径超过NPs2和NPs3的粒径 （图1g-i，图S4）。原子力显微镜 (AFM) 结果表明， 大多数肽纳米粒子的高度在20到50 nm之间，与TEM结果基本一致 （图S5）。动态光散射结果表明肽纳米粒子的流体动力学直径分布非常广，多个肽纳米粒子能够聚集成粒径更大的不规则簇（图S6）。
图1 a）NPs1分子结构设计为自组装核心结构单元、疏水单元、正电荷单元和亲水单元。b）嵌合肽NPs1、NPs2和NPs3的分子结构和示意图。c）构成嵌合肽的氨基酸（赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸）的结构。d–f）嵌合肽NPs1、NPs2和NPs3的浓度依赖性自组装和CMC。g–i）128×10 -6 M浓度的 嵌合肽NPs1、NPs2和NPs3透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺：200 nm。
通过最低抑菌浓度（MIC）测定法测定自组装嵌合肽的抗菌活性。如图2a所示，肽两亲物NPs1、NPs2和NPs3对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌（如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）具有广谱抗菌活性。此外， 两亲肽的MIC值接近甚至低于其CMC，这与之前的研究结果一致。
肽基纳米材料系统给药的一个挑战是它们对细胞和红细胞血液相容性和潜在毒性。因此，对自组装嵌合肽的溶血活性和细胞毒性进行了评估。如图2b所示，在64×10 -6 M的浓度下，嵌合肽对HEK293T细胞没有细胞毒性。随后，我们使用激光共聚焦显微镜直接观察细胞状态。碘化丙啶（PI）是一种膜渗透染料。 当细胞膜被破坏，细胞通透性增加时，PI进入细胞并在嵌入双链DNA后释放红色荧光。 SYTO9可以穿过活细胞的细胞膜，与DNA结合，发出绿色荧光。如图2c所示，在64×10 -6 M的浓度下，嵌合肽NPs1、NPs2和NPs3显示出良好的生物相容性，只导致少数细胞死亡。同样，在溶血活性试验中（图3a），所有嵌合肽显示出较低的溶血活性，并且在128×10 -6 M的浓度下诱导红细胞溶血可以忽略不计（图3b）。这些结果表明， 嵌合肽在体外表现出良好的细胞相容性。 我们推测，嵌合肽表现出的高细胞相容性与PEG的“隐形效应”有关。具体来说，PEG附着到纳米颗粒上以屏蔽部分带电区域；这可以防止与真核细胞的意外物理接触以及与红细胞的相互作用。尽管PEG共轭屏蔽了纳米颗粒表面的一些带电区域并降低了它们的毒性，但纳米颗粒的抗菌活性并未丧失。这是因为真核细胞和细菌的膜结构本质上是不同的。更具体地说， 对于细菌，阴离子脂质暴露在膜表面；同时，在真核细胞膜中，阴离子脂质分布在面向细胞器的膜内。 因此，阳离子嵌合肽可以优先与细菌膜结合，实现更好的细菌选择性。
在复杂的生理环境中，蛋白酶和盐类对抗肽类抗菌药物的抗菌活性，这已成为其临床应用的重要障碍。具体而言，一价或二价游离阳离子（例如，Na + 和Mg 2+ ）竞争性地结合到细菌膜上，从而削弱肽和细菌膜之间的静电相互作用。此外，高价阳离子（例如Fe 3+ ）还与细菌膜表面的阴离子基团结合，以增加其硬度，从而削弱肽的攻击作用。如图2d，e所示，Na + 和Mg 2+ 降低了所有嵌合肽的抗菌活性，剩余的盐对抗菌活性没有显著影响。我们认为，在肽两亲分子NPs1和NPs2的CMC上方形成纳米颗粒，肽质量的高局部密度和正电荷可能会加强与细菌膜的静电相互作用，从而削弱阳离子对纳米颗粒抗菌活性的影响。然而， 与NPs1和NPs2相比，NPs3的盐稳定性较差，并且在Na + 存在下抗菌活性几乎完全丧失。这一结果很可能是因为在NPs3形成纳米颗粒后，在PEG插入位置的影响下，PEG位于完全包裹纳米颗粒的“壳”上 ；因此， 微粒的电荷屏蔽效应会影响纳米粒子和细菌膜之间的静电相互作用。 此外，由于Na + 在所有盐中的浓度最高，它对嵌合肽的活性影响最大。在Na + 存在下，嵌合肽NPs1的抗菌活性略强于NPs2，这可能是因为NPs1上的PEG更接近疏水端，而NPs2上的PEG更远离疏水端，从而产生更强的电荷屏蔽效应。
根据上述结果，NPs3的盐稳定性较差，不符合选择要求。因此，选择NPs1和NPs2作为蛋白酶稳定性的研究对象。众所周知，阳离子和疏水性是肽基抗菌药物发挥抗菌活性的先决条件。然而，在生理环境中，阳离子氨基酸和疏水氨基酸是多种蛋白酶的优良底物。例如，胰蛋白酶优先裂解阳离子氨基酸（Arg或Lys）的C端，胰凝乳蛋白酶优先裂解疏水氨基酸（Phe、Tyr或Leu）的C端，胃蛋白酶优先裂解Phe、Leu、Trp或Tyr的N端和C端。因此，在我们的设计理念中，我们采用了多种策略来抵抗蛋白酶对嵌合肽的切割。一方面，Pro被放置在阳离子氨基酸（Lys）和疏水氨基酸（Phe）的两端，以减少蛋白酶的识别和切割；另一方面，当肽两亲分子的浓度超过CMC时，肽两亲分子自组装成纳米颗粒会增加侧链的密度，并可能降低蛋白酶的可及性。如图2f-i所示， 在嵌合肽NPs1和NPs2用8 mg/mL处理后蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶）作用1小时，其抗菌活性基本保持不变，这表明自组装嵌合肽高度稳定，不能被蛋白酶切割。 RP-HPLC用于进一步测定嵌合肽的蛋白水解稳定性。与对照组（用蛋白酶处理0小时）相比，在用胃蛋白酶、胰蛋白酶或糜蛋白酶（浓度为4或8 mg/mL）处理后，嵌合肽的色谱峰形状和面积保持完整持续8小时，表明嵌合肽在蛋白酶存在下非常稳定（图2j、k，图S8-S11，附加信息）。以上结果表明， 嵌合肽NPS1和NPS2在体外具有良好的稳定性，为进一步的体内研究奠定了基础。
图2 a）嵌合肽的最小抑制浓度（MIC）。b）嵌合肽对HEK293T的细胞毒性。c）用64 × 10 −6 M嵌合肽处理的HEK293T细胞的活/死荧光图像。比例尺：50 μm。d，e）在生理盐存在下，肽纳米颗粒对d）大肠杆菌 ATCC25922和e）金黄色葡萄球菌ATCC6538 的 MIC 值。NaCl、KCl、NH 4 Cl、MgCl 2 、ZnCl 2 、FeCl 3 的最终浓度分别为 150×10 −3 ，4.5×10 −3 、6×10 −6 、1×10 −3 、8×10 −6 和 4×10 −6 M。f，g）肽纳米颗粒NPs1对f）大肠杆菌ATCC25922或g）金黄色葡萄球菌ATCC6538与不同蛋白酶孵育1小时后的MIC。h，i）肽纳米颗粒 NPs2对h）大肠杆菌ATCC25922或i）金黄色葡萄球菌ATCC6538与不同蛋白酶孵育1小时后的MIC值。j，k）嵌合肽j）NPs1和k）NPs2在与8 mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶或糜蛋白酶孵育8小时后进行 RP-HPLC分析。
上述结果表明， 嵌合肽NPs1和NPs2具有广谱抗菌活性、高细胞相容性和优异的稳定性。 因此，我们将其作为抗菌机制的研究对象。根据阳离子和疏水设计的初衷，我们假设嵌合肽的作用机制是物理破坏细菌膜。因此，我们选择了革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌作为杀菌机制的研究对象。两亲肽抗菌作用的第一步是与细菌膜表面的特定成分产生静电相互作用。 脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA）分别是革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌膜表面独特的带负电荷的成分，它们是肽基抗菌药物的主要结合位点。 如图3c、d所示，嵌合肽NPs1和NPs2与大肠杆菌LPS和金黄色葡萄球菌LTA的亲和力表现出剂量依赖性效应，即当浓度增加时，亲和力逐渐增加。为了进一步研究嵌合肽和LPS（或LTA）的特异性结合能力，我们通过表面等离子体共振光谱测定了NPs1和NPs2与LPS（或LTA）的相互作用。如图3g-j所示，肽（作为配体）和LPS（或LTA）（作为分析物）在1.56–25 μg/mL浓度下的结合显示出剂量依赖性效应。动力学分析结果表明，肽NPs1和NPs2与LPS的亲和力KD为5.56×10 −5 和3.08×10 −5 ，与LTA的亲和力分别为2.65×10 −5 和1.71×10 −5 ，表明 肽和LPS（或LTA）之间存在明显的亲和力。 此外，支持信息的表S1中列出了其他结合参数，包括解离常数（Kd）和结合常数（Ka）。
革兰氏阴性菌具有独特的外膜，提供额外的保护。由于孔蛋白的存在，这种外膜具有一定程度的渗透性，尽管它不足以让肽基抗菌药物通过。在大多数情况下，肽基抗菌药物可以与外膜表面带负电荷的成分结合，以去除阳离子，使外膜结构松散，并允许较大的分子通过外膜。另一方面，肽基抗菌药物的疏水核心可以直接插入外膜，对其进行物理破坏。N-苯基-1-萘胺（NPN）是一种疏水性、灵敏的荧光探针。一旦外膜结构松动，NPN进入细胞并在与疏水环境接触时发出荧光。如图3e、f所示，嵌合肽NPs1和NPs2以剂量依赖性方式穿透大肠杆菌外膜。当肽浓度超过16×10 − 6 M时，荧光几乎达到最大值，这表明 肽在CMC上方自组装成纳米颗粒，几乎破坏了悬浮液中所有大肠杆菌的外膜。
图3. a）红细胞采集和溶血活性测定示意图。b）样品溶血的照片（对照、NPs1、NPs2、NPs3 和 Triton X-100）。c）肽纳米颗粒对来自大肠杆菌的LPS的结合亲和力。d）肽纳米颗粒对来自金黄色葡萄球菌的LTA的结合亲和力。e，f）肽纳米颗粒e）NPs1和f）NPs2诱导的大肠杆菌ATCC25922的外膜渗透性。g）肽纳米颗粒 NPs1 和 LPS 相互作用动力学的SPR光谱。h）肽纳米颗粒 NPs2 和 LPS 的相互作用动力学的SPR光谱。i）纳米粒子NPs1和LTA的相互作用动力学的 SPR 光谱结果。j）嵌合肽NPs2和LTA的相互作用动力学的SPR光谱。k，l）由肽纳米颗粒NPs1诱导的k）大肠杆菌 ATCC25922和l）金黄色葡萄球菌ATCC6538的细胞质膜渗透性。m,n）由肽纳米颗粒NPs2诱导的m）大肠杆菌ATCC25922和n）金黄色葡萄球菌ATCC6538的细胞质膜渗透性。o,p）用16 × 10 −6 M嵌合肽处理的o）大肠杆菌ATCC25922p）金黄色葡萄球菌ATCC6538的活/死荧光图像。比例尺：10 μm。
除上述外膜外，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有保护细胞质膜的细胞壁。因此，DiSC 3 -5被用于进一步研究细胞质膜的潜在变化。这种阳离子染料集中在细胞质膜内，导致荧光猝灭。当细胞质膜电位改变时，荧光增强。因为嵌合肽NPs1和NPs2在浓度为16×10 -6 M时几乎破坏了所有大肠杆菌的外膜，我们使用的浓度不超过16×10 -6 M。在这个实验中。如图3k–n所示， 这两种嵌合肽以剂量依赖性方式诱导大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞质膜在600秒内持续释放荧光。 此外，嵌合肽NPs1和NPs2诱导的荧光增加大约200秒达到最大值，然后稳定下来。基于上述研究结果，我们认为NPs1和NPs2通过静电相互作用优先聚集在细菌膜表面。当肽浓度超过CMC时，革兰氏阴性菌外膜的通透性显著增加；同时，细胞质膜的去极化程度增加。同样，对于革兰氏阳性细菌，嵌合肽可以穿过细胞壁屏障，使细胞质膜去极化。
为了定性和定量地验证嵌合肽的抗菌机理，使用激光共聚焦显微镜和流式细胞术进一步分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。采用SYTO9/PI染料对大肠杆菌进行活/死染色。如图3o，p所示，浓度为16×10 −6 M的纳米粒子NPs1和NPs2诱导的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的绿色和红色荧光重叠明显，表明 它们的细胞膜受到严重破坏 。流式细胞术分析结果表明， 当嵌合肽NPs1和NPs2的浓度接近MIC，他们导致大约50%的大肠杆菌细胞死亡 （图4a，b）。然而，将嵌合肽的浓度增加一倍，会大大增加阳性细胞的比例；这与外膜通透性测定的结果一致，这表明肽浓度超过CMC后的自组装将显著增强革兰氏阴性细菌膜的破坏。此外，由于金黄色葡萄球菌没有受到外膜的额外保护，在用浓度为8×10 − 6 M和16×10 − 6 M的嵌合肽处理后，其死亡率超过了大肠杆菌。为了阐明嵌合肽在细菌细胞中诱导的生理变化，我们对细胞周期进行了流式细胞术分析。如图4c-j所示， 在用嵌合肽NPs1或NPs2处理后，S期和G2期的大肠杆菌细胞显著增加，表明它们的细胞周期在S期和G2期被阻滞。 这种现象在金黄色葡萄球菌细胞中更为明显，在用嵌合肽处理后，大多数金黄色葡萄球菌细胞在G2期被阻滞。因此，嵌合肽的杀菌机理并不局限于膜裂解。嵌合肽纳米粒子干扰细胞代谢，抑制重要的细胞生理活动，干扰正常细胞周期，并导致细胞死亡。
用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察细菌的形态变化。扫描电镜结果表明， 未经处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜表面完整光滑。 经16×10 −6 M处理后嵌合肽，细胞膜表面出现褶皱，细胞外可观察到泄漏内容物（图4k-p）。透射电镜下，对照组细菌膜结构完整，胞质致密。经16×10 −6 M嵌合肽处理后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜破裂，细胞内容物泄漏（图4q-v）。综上所述，已证实嵌合肽的抗菌机制涉及多种途径，包括穿透细菌膜和破坏细菌细胞周期；此外，通过SEM和TEM观察到的内容物泄漏是多种因素综合作用的结果。
图4. a,b）通过流式细胞仪检测用嵌合肽处理的a）大肠杆菌 ATCC25922或b）金黄色葡萄球菌ATCC6538细胞。c-e）大肠杆菌的细胞周期。c）对照，d）用8 × 10 -6 M NPs1处理，和e）用8 × 10 -6 M NPs2处理。f）大肠杆菌中细胞周期百分比的图形表示。g-i）金黄色葡萄球菌的细胞周期：g) 对照，h）用8 × 10 -6 M NPs1处理，i）用 8 × 10 -6 M NPs2处理。j）金黄色葡萄球菌中细胞周期百分比的图形表示。k-m）k）未经处理的大肠杆菌ATCC25922和用16 × 10 -6 M嵌合肽l）NPs1和m）NPs2处理的大肠杆菌ATCC25922的SEM图像。n-p）n）未经处理的金黄色葡萄球菌ATCC6538和用16 × 10 -6 M肽纳米颗粒o）NPs1和p）NPs2处理的金黄色葡萄球菌 ATCC6538的SEM图像。比例尺：2 μm。q-s）q）未经处理的大肠杆菌ATCC25922和用16 × 10 -6 M嵌合肽r）NPs1和s）NPs2处理的大肠杆菌ATCC25922的TEM图像。t-v）t）未经处理的金黄色葡萄球菌ATCC6538和用16 × 10 -6 M嵌合肽u）NPs1和v）NPs2处理的金黄色葡萄球菌ATCC6538的TEM图像。比例尺：500 nm。
为了进行临床试验，我们将低剂量（15 mg/kg）和高剂量（30 mg/kg）的嵌合肽腹腔注射到C57BL/6小鼠体内，并通过定量评分、体重变化以及肝脏和肾脏相关指标评估这些嵌合肽的潜在不良反应（图5a）。全身给药后，小鼠的行为在2小时内恢复到正常水平。在7天的试验期间， 各组小鼠的体重在统计学上没有显著差异 （图5b）。肝脏和肾脏分别是体内药物代谢和代谢物清除的主要场所；因此，在观察期结束后，计算小鼠肝脏和肾脏的相对器官重量。如图5c、d所示， 在试验期后，各组小鼠之间的相对器官重量没有显著差异。 此外，与肝和肾功能相关的参数，包括肌酐、尿素、尿酸、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素和碱性磷酸酶维持在正常生理水平，表明 嵌合肽不会诱发肝毒性或肾毒性 （图5e-k）。组织学检查显示，与对照组相比，低剂量（15 mg/kg）和高剂量（30 mg/kg）治疗组没有出现组织学异常（图5l）。这些结果表明，当嵌合肽NPs1和NPs2的腹腔注射剂量小于30 mg/kg时，对小鼠的副作用可以忽略，表明嵌合肽NPs1和NPs2在体内具有良好的生物相容性。
图5. a）肽纳米颗粒生物相容性的体内小鼠模型示意图。b）C57BL/6小鼠施用肽纳米颗粒（0、15 或 30 mg/kg）后体重的变化。c，d）在施用肽纳米颗粒7天后小鼠中c）肝脏和d）肾脏的相对器官重量。e-g）小鼠在嵌合肽给药7天后的肾功能指标和h-k）肝功能相关指标。l）不同浓度肽纳米颗粒给药7天后小鼠肝脏和肾脏的组织病理学形态分析。比例尺：100 μm。
为了确定自组装嵌合肽NPs1和NPs2在体内的治疗效果，我们使用大肠杆菌建立系统性脓毒症模型。脓毒症是一种全身炎症反应综合征，由细菌侵入人体引起；它是一种常见的系统性感染，病死率高。脓毒症的病因之一是革兰氏阴性细菌释放的内毒素会导致失控的炎症反应和免疫功能障碍。与传统抗生素相比，肽基抗菌药物在治疗败血症方面的优势之一是， 带正电的嵌合肽可以中和带负电的内毒素，从而减少身体的炎症反应。 此外，嵌合肽的膜破坏机制使细菌难以产生耐药性。因此，我们首先评估了挑战菌株对嵌合肽NPs1和NPs2产生耐药性的能力，并使用粘菌素作为对照。如图6b所示， 在亚MIC浓度下连续传代期间，未观察到对嵌合肽的耐药性。 作用机理研究结果表明， 嵌合肽主要通过穿透和破坏细菌膜发挥抗菌作用。 细菌必须改变其膜结构，以抵抗纳米粒的攻击。因此，纳米粒子诱导细菌耐药性的可能性很低。作为对照，对照组的抗菌活性在检测期结束后降低了大约32-64倍。据报道，粘菌素的耐药性与质粒介导的基因MCR1（移动粘菌素耐药性）在不同菌株之间的传播以及向LPS中添加阳离子基团（如L-Ara4N和pEtN）有关。随后，为了阐明嵌合肽对大肠杆菌的杀菌程序，我们测量了它们的时间杀伤曲线。如图6c、d所示，在浓度为8×10 -6 M下，嵌合肽NPs1和NPs2不能完全杀死大肠杆菌。暴露于浓度为16×10 -6 M的嵌合肽中120分钟，溶液中几乎所有的大肠杆菌都被杀死，尽管嵌合肽的灭菌速度没有显著提高。
根据体内毒性研究的结果，我们选择了安全剂量的嵌合肽（15 mg/kg） 用于体内活性评估（图6a）。在小鼠感染大肠杆菌后，治疗组给予15 mg/kg嵌合肽NPs1或NPs2，生理盐水治疗组作为对照。感染12小时后，对小鼠进行尸检，并对器官中的菌落进行计数。与生理盐水治疗相比，使用嵌合肽NPs1和NPs2治疗后，肝、肾、脾和肺中的细菌负荷显著减少（图6e-h）。此外，与生理盐水治疗组相比，促炎因子TNF-α, 白细胞介素-6和白细胞介素1β（IL-1β) 水平显著降低（图6j-l）。这些结果表明， 嵌合肽不仅具有直接的抗菌作用，而且还具有免疫调节特性。 这些作用相辅相成，有助于预防系统性细菌感染。H&E染色显示了感染小鼠组织中的病理变化，包括肝细胞损伤、肾小球周围的空泡和炎性细胞浸润（图6i）。嵌合肽治疗后，组织损伤在很大程度上得到了预防或修复。
图6. a）小鼠全身感染模型的实验装置示意图。b）大肠杆菌 ATCC25922 对亚 MIC 浓度的药物产生耐药性。c,d）嵌合肽c）NPs1或d）NPs2 在 8 × 10 -6 和16 × 10 -6 M浓度下对大肠杆菌ATCC25922的杀伤动力学。e-h）用生理盐水和纳米颗粒NPs1和NPs2处理后小鼠肝脏、脾脏、肺和肾脏的细菌负荷。i）用生理盐水和嵌合肽NPs1和NPs2处理的健康小鼠和感染小鼠的肝、脾、肺和肾组织的组织病理学 H&E 染色。比例尺：100 μm。j-l）用生理盐水和嵌合肽NPs1和NPs2处理的健康小鼠和大肠杆菌感染小鼠的血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。
禁止在动物饲养场的饲料和养殖中添加饲料抗生素的政策，导致对断奶仔猪等幼畜的抗生素替代品需求增加。此外，作为试验动物，猪的生理学和生理学与人类相似，免疫反应与人类相似。以猪为模型可以更好地反映抗菌药物的疗效以及病原体与宿主的相互作用。因此，以仔猪为靶动物，进一步验证了嵌合肽的体内活性。如图7（原文中图S12）所示， 与生理盐水治疗组相比，嵌合肽NPs1和NPs2治疗组器官中的细菌负荷显著减少，炎症因子水平减轻。 此外，受感染的小猪出现肝窦扩大、脾脏轻微出血、肺出血和水肿。用嵌合肽处理的仔猪的肝、脾、肺和肾与对照组几乎没有差异。总的来说，这些数据表明，嵌合嵌合肽可以减少系统性细菌感染引起的组织损伤和炎症因子紊乱，并且有利于治疗败血症和细菌感染。
图7. a）仔猪全身感染模型实验示意图。b-e）用生理盐水和纳米颗粒NPs1和NPs2处理后，仔猪肝脏、脾脏、肺和肾脏中的细菌负荷。f）健康仔猪的肝脏、脾脏、肺和肾脏组织的组织病理学H&E染色，以及用盐水、嵌合肽 NPs1 或 NPs2 处理的感染仔猪。g-i）用盐水、嵌合肽NPs1或NPs2处理的健康仔猪和大肠杆菌感染仔猪的血清 IL-6、IL-1β和TNF-α水平（原文中图S12）。
结论
在这项研究中，报道了一种由烷基链、疏水单元、带正电单元和PEG单元组成的自组装嵌合嵌合肽。本研究的重点是鉴定嵌合嵌合肽的体外抗菌活性、稳定性和生物相容性，并详细讨论了其杀菌机制。结果证实， 自组装嵌合肽NPs1和NPs2具有广谱抗菌活性、良好的生物相容性以及优异的盐和蛋白酶稳定性。 同时，嵌合肽NPs1和NPs2在治疗全身感染方面显示出应用潜力。机理研究结果表明，嵌合肽与膜表面带负电荷的成分相互作用，破坏整个膜结构，影响细胞周期，最终导致细菌内容物泄漏而死亡。总而言之，这些发现可能为设计高效、安全的肽基抗菌纳米材料提供理论基础，并有望在不引起细菌耐药性的情况下解决人类健康和畜牧业中的抗生素短缺问题。
微文推荐阅读
-
土壤微生态文献包免费领取 | 150篇近两年高影响因子土壤微生态相关文章
-
根际微生态文献包免费领取 | 60篇近两年高影响因子植物根际微生物相关文章
-
肠道微生态文献包免费领取 | 100篇近两年高影响因子肠道菌群与消化道疾病相关文章
-
元素循环微生态文献包免费领取 | 60篇近两年高影响因子植物-土壤碳氮磷相关文章
微生态公众号 长期接受科研文章投稿 ，若您有科研成果想要与更多老师分享交流，欢迎联系微科盟组学老师投稿，本公众号 免费刊登 。
微生态科研学术群期待与您 交流更多微生态科研问题
（ 联系您所添加的 任一微科盟组学老师即可 ，如未添加过微科盟组学老师，请联系多组学老师19， 无需 重复添加 ）。
了解更多菌群知识，请关注“微生态”。
点击阅读原文 ，直达原文网站，如需原文PDF可联系组学老师获取