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科研丨内蒙古农大张和平、孙志宏教授团队（IF：8）：益生菌给药增强抗PD-1抗肿瘤治疗效果（国人佳作）

时间：2022-07-01 来源： 浏览：

科研丨内蒙古农大张和平、孙志宏教授团队（IF：8）：益生菌给药增强抗PD-1抗肿瘤治疗效果（国人佳作）

微科盟九卿臣 微生态
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编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

免疫治疗是对多种恶性肿瘤进行科学研究和临床治疗的一种较新的方法。其中免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade，ICB）是通过激活T淋巴细胞介导的免疫应答来提高肿瘤的免疫监测。肿瘤微环境中的免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）通过拮抗T细胞上的负调节因子来抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。然而，由于患者之间的个体差异，只有少数患者从ICIs中获益。 抗生素摄入往往导致治疗的不良结果和免疫应答低效，而ICB成功用于肿瘤治疗的证据表明疗效与宿主的肠道菌群有关。 外源性益生菌的应用可能是提高ICB疗效的一种有前景的方法。然而益生菌与ICIs在肿瘤抑制中的协同作用似乎具有菌株特异性，因此有必要评估单个候选益生菌菌株在ICB治疗中的疗效。

本研究旨在评估鼠李糖乳杆菌Probio-M9在恢复被抗生素破坏的肠道菌群及其对荷瘤小鼠ICB治疗的效果。首先用抗生素破坏小鼠肠道菌群，然后经益生菌调节或自然恢复，随后是基于PD-1的抗肿瘤治疗。在实验不同阶段监测粪便宏基因组及抑瘤效果的变化。结果表明，和未接受益生菌的组相比，Probio-M9协同ICB治疗显著抑制了肿瘤增长（ P <0.5）。协同作用还能有效恢复被抗生素破坏的粪便微生物群，其特征是Shannon多样性值大幅降低，优势类群组成发生变化。此外，益生菌的使用显著增加了有益菌的相对丰度（0.0001< P <0.05）。 肠道菌群的变化伴随着功能性宏基因组的轻度重塑，其特征是糖降解、维生素和氨基酸合成途径的富集。 综上所述，本研究认为 Probio-M9可作为未来基于微生物协同肿瘤治疗研究的候选菌株 。获得的数据将支持未来人体临床试验的设计，并评估益生菌辅助治疗在ICB治疗中的安全性。

论文ID

原 名： Adjunctive probiotic Lactobacillus rhamnosus Probio-M9 admin126459646istration enhances the effect of anti-PD-1 antitumor therapy via restoring antibiotic-disrupted gut microbiota

译 名 ： 辅助益生菌鼠李糖乳杆菌Probio-M9给药通过恢复抗生素破坏的肠道微生物群增强抗PD-1抗肿瘤治疗的效果

期刊 ： Frontiers in Immunology

IF： 8.786

发表时间： 2021.12

通讯作 者： 张和平、孙志宏

通讯作者单位： 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号： 10.3389/fimmu.2021.772532

实验设计

本实验采用CT26.WT结直肠癌细胞系和SPF级balb/c小鼠构建荷瘤动物模型。小鼠随机分为4组：药物对照组（MC）、联合治疗组（CT）、单独使用益生菌组（PA）和阴性对照组（NC；每组9只）。实验分为4个阶段： 抗生素处理、益生菌干预、肿瘤生长和抗PD-1免疫治疗。 在实验的不同阶段监测粪便宏基因组的变化及抑瘤效果。随后用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 提取粪便总DNA，建库后对150 bp长度进行正反向测序。接下来使用KneadData进行reads质量控制，并使用Bowtie2去宿主DNA，经过过滤得到881.88 Gbp的高质量数据。

图1 实验设计示意图（原文中图1A）。

前言

免疫治疗是通过免疫检查点阻断（ICB）来实现的，它激活T淋巴细胞介导的免疫反应来改善肿瘤的免疫监测。肿瘤微环境中的免疫检查点抑制剂（ICIs）通过拮抗T细胞上的负调控因子来抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。这类分子包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡受体1（PD-1）和程序性死亡配体1（PD-L1），是目前临床应用于ICB治疗的三个主要靶点。

ICB疗法已成功应用于实体瘤的临床治疗，如黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、DNA错配修复缺失型结直肠癌等。部分患者免疫治疗后缓解率显著改善。然而，由于患者之间的个体差异，只有少数患者受益于ICIs。研究支持ICB的疗效与宿主肠道菌群的特征相关。抗生素使用后肠道失调和有益微生物亚群的急剧减少损害了小鼠和患者的癌症治疗效果。因此， 可以通过益生菌、益生元、后生元等饮食干预和粪菌移植等管理方法对肠道菌群进行靶向调节，促进ICB的疗效。 双歧杆菌和 Akkermansia   muciniphila 可通过促进树突状细胞的抗原呈递来增强宿主对ICB治疗的免疫应答。鼠李糖乳杆菌GG可以提高小鼠的抗肿瘤免疫力。这些结果支持了使用外源性益生菌可能是提高ICB疗效的一种方法。益生菌与ICIs对肿瘤抑制的协同作用似乎有菌株特异性；因此，有必要评估单个益生菌株在ICB治疗中的疗效。

鼠李糖乳杆菌Probio-M9可能是通过恢复肠道菌群来抑制结肠炎相关的致癌作用。我们假设，基于抗PD-1的抗肿瘤治疗的疗效需要完整的宿主肠道菌群，证实益生菌可以恢复由外部刺激引起的肠道菌群破坏。因此，本研究旨在评估 该菌株对抗生素破坏的肠道菌群的恢复效果，以及其对异位结肠直肠癌体内模型中ICB治疗效果的影响。

结果

1 Probio-M9提高了抗PD-1免疫治疗的疗效
第24天，CT组肿瘤最小（1681.02±77.86 mm 3 ），其次为MC组（2511.05±83.64 mm 3 ），PA组（2867.67±144.60 mm 3 ），NC组肿瘤体积最大（3695.74±134.39 mm 3 ，图2B）。与其他组相比，抗PD-1治疗显著降低了肿瘤体积（第24天 P <0.05），无论是否补充益生菌，抗PD -1治疗均有效抑制肿瘤。在任何监测时间点，PA组与NC组肿瘤体积无显著差异，Probio-M9单独作用对肿瘤抑制不显著。补充益生菌增强了抗PD -1治疗的抗肿瘤效果（第14天CT组和MC组 538.63±24.03和807.29±24.03 mm 3 ， P  =0.014；第18天1087.22±53.67和1371.28±47.01 mm 3 ， P =0.258；第24天1681.02±77.86和2511.05±83.64 mm 3 ， P =0.014），表明在 第一次抗PD -1抗体注射后4天就出现了协同作用 （图2B）。
与抑制肿瘤体积效果一致，CT组存活率最高（77.8%，PA组33.3%，MC组22.2%，NC组0%；图2C）；而MC组的存活率仅略高于NC组，表明 部分荷瘤小鼠的生存需要益生菌的协同抑瘤作用 （图2C）。
 
图2 宿主菌群调控对PD-1抗体抗肿瘤治疗的影响。（B）CT26肿瘤生长动力学和（C）四组小鼠存活率。Wilcoxon检验有显著性差异显示（ P <0.05）。数据以平均值±SEM表示（n = 9）（原文中图1B, C）。
 
2 宏基因组学揭示了抗生素和益生菌治疗后肠道菌群的变化
为评估不同处理下肠道菌群的动态变化，对162只小鼠粪便样本进行宏基因组测序【 6个采样时间点×3组（CT、MC、NC）×每组9只小鼠 】。PA组采集的粪便样本不进行宏基因组测序，与NC组相比，其抑瘤效果不显著（表1）。
Shannon多样性无显著性差异，PCoA评分图未见明显的分组聚类模式（图3A），说明 在任何治疗开始前，组间整体菌群多样性和结构均无明显差异 。抗生素治疗两周后，与基线相比，Shannon指数下降（ P <0.001），而Bray-Curtis距离显著增加（Adonis试验， P <0.001），表明抗生素破坏了肠道菌群的多样性和结构（图3B）。之后对各组小鼠进行益生菌干预或自然恢复被抗生素破坏的肠道菌群。第24天，各组的Shannon多样性指数恢复到基线水平，而只有CT组肠道菌群结构与基线相比有显著差异，MC组和NC组均无差异（Adonis检验， P <0.018；图3C和图S1），说明 肠道菌群可以在没有外界干预的情况下自然恢复，Probio-M9干预对肠道菌群的调节与自然恢复不同。
给予抗生素和益生菌后，粪便微生物群组成也发生了变化。肠道菌群的主要成分为 Muribaculaceae bacterium  DSM 103720（22.86%到30.78%）， Lactobacillus murinus （15.25%到18.42%）和 Prevotella （14.48%到34.59%）。抗生素处理极大消除了原来的优势类群，使 Escherichia coli ， Enterococcus gallinarum 和 Bacteroides 在菌群中占据优势（这三个类群在每组中所占的总比例为>51.87%）。在第24天，大多数类群的相对丰度恢复到原来水平（图3D和表S1）。
 
图3 肠道菌群多样性、结构和组成的动态变化。肠道菌群的Shannon多样性指数和主坐标分析（A）基线时，（B）抗生素治疗后，（C）干预结束时。MC，药物对照；CT，联合治疗；NC，阴性对照（NC）。组标签后的数字代表对应的采样时间点（1：-28天，2：-14天，6：24天。（D）MC组、CT组和NC组在-28天、-24天和24天的粪便微生物组成（分别表示抗生素和益生菌治疗前和抗PD -1靶向治疗结束时的时间点）。T检验和Adonis检验评价组间差异（原文中图2）。
 
  表1 宏基因组测序各样本数据量。
MC，药物对照；CT，联合治疗；NC，阴性对照。
 
3 抗生素、Probio-M9和抗PD -1治疗对关键敏感细菌种类的影响
为了进一步分析抗生素或益生菌对小鼠肠道菌群组成的影响，随后确定了对这些治疗有显著差异反应的丰富物种。总体而言， 对抗生素处理反应显著的物种有13种，其中 A. muciniphila ，  Bacteroides vulgatus ，  Enterococcus gallinarum 和 Escherichia coli 的相对丰度显著增加，其他物种的相对丰度显著降低 （ P  < 0.05，图S2A，B）。
抗生素治疗后，肠道菌群自然恢复或益生菌干预两周。CT组六种细菌 （ Bacteroides vulgatus ，  Citrobacter amalonaticus ，  Clostridium  sp. ASF502 ，   Escherichia coli ，  Muribaculaceae bacterium   DSM 103720 和 Prevotella  sp. MGM2）的相对丰度显著高于其他两组（MC，NC；  P <0.05）， Clostridium  sp. ASF502， Muribaculaceae bacterium  DSM 103720和 Prevotella  sp. MGM2的比例仅在Probio-M9灌胃后第-14天到第0天有所增加（ P <0.05）。在没有Probio-M9的另外两组中没有观察到这种趋势（图S2C，D）。此外，Probio-M9处理使 B. pseudolong um 的相对丰度增加了136倍，而 A. muciniphila 的相对丰度减少了12倍，但它们的变化无统计学意义（ B. pseudolongum   P =0.078， A. muciniphila P =0.068；图S2D）。这些结果表明，肠道菌群对Probio-M9处理的反应存在很大的个体差异，但一些菌种如 A. muciniphila  和 B. pseudolongum 对大多数小鼠的治疗都有反应。
由于益生菌而非抗生素，物种的数量发生了显著变化，即 在抗生素治疗后无显著变化，但在第0天至第24天的相对丰度发生了显著变化 。 Bacteroides intestinalis ，  Bacteroides xylanisolvens ，  B. pseudolongum ，  Clostridium  sp. ASF502 ，   Lachnospiraceae bacterium A2和 Parabacteroides distasonis    CT组明显多于MC组或NC组（图4A；0.0001< P  <0.05），而在 Bacteroides faecichinchillae ，  Bacteroides thetaiotaomicron ，  Prevotella  sp. MGM1 ，   Mucispirillum schaedleri ，  Clostridium  sp. ASF356和 Lachnospiraceae bacterium  A4中出现相反趋势（图4B； 0.001< P <0.05 ）。 Bacteroides faecichinchillae ，  Bacteroides intestinalis ，  Bacteroides thetaiotaomicron ，  L. bacterium  A2 ，   L. bacterium A4和  P. distasonis 的相对丰度在肿瘤生长和治疗过程中存在显著变化（图4C）。
 
图4 Probio-M9对关键微生物物种的特异性调控。添加Probio-M9后，物种数量显著增加（A），减少（B）。（C）干预后物种变化显著。分组：药物对照（MC）、联合治疗（CT）、阴性对照（NC）。误差柱代表SEM。* 代表 P  < 0.05；* * 代表 P < 0.01；* * *代表 P  < 0.001（原文图3）。
 
4 抗生素、Probio-M9和抗PD -1治疗对肠道菌群代谢潜能的影响
由于抗生素和益生菌会影响小鼠肠道菌群的结构和组成，因此可以预测其粪便功能宏基因组会发生变化。通过HUMAnN2分析粪便宏基因组中的功能基因，得到485条通路（表S2）。272条途径的基因丰度在三组中显著改变（ P <0.05；表S3）。 在CT组、MC和NC组之间发现了9条差异显著的丰富通路，这可能与添加外源Probio-M9有关 （CT组 P <0.05，MC和NC组 P >0.05；表S4）。
在植入肿瘤和抗PD-1治疗阶段，CT组生物素生物合成I、异乳酸发酵、甘露聚糖降解、硝酸盐还原VI（同化）、戊糖磷酸途径、丙酮酸发酵为丁醇II、糖酵解和Entner-Doudoroff、CDP -二酰基甘油生物合成I的基因丰度增加，而其他途径，如8-氨基-7-氧硝酸生物合成I、己糖醇发酵为乳酸、甲酸、乙醇和乙酸、乙酰辅酶A生物合成超途径、全反式法尼醇生物合成、硫酸软骨素降解I、N -乙酰神经氨酸降解超途径等途径含量较低（图5）。 在抗PD-1免疫治疗期间，益生菌干预的功能性肠道宏基因组保持不变，这可能是Probio-M9协同抑瘤的原因 。
 
图5 Probio-M9对肠道宏基因组潜能的影响。添加Probio-M9后，通路的基因丰度显著增加（A），降低（B）。分组：药物对照（MC）；联合治疗（CT）。*代表 P  < 0.05；* * 代表 P < 0.01（原文中图4）。
 

讨论

本研究使用抗生素破坏小鼠肠道菌群构建结直肠癌体内异味模型，评估益生菌 L. rhamnosus Probio-M9对基于PD-1的ICB治疗的影响。有趣的是，在后续ICB治疗中，抗生素后使用益生菌可增强小鼠对肿瘤生长的抑制作用，其抑瘤效果明显强于未使用益生菌的小鼠（ P <0.05）。这与前期研究的观察结果一致，说明 Probio-M9对正位和异位结肠癌的治疗均有促进作用 。
在动物实验的不同阶段采集粪便样本进行宏基因组测序，监测抗生素、益生菌和抗PD -1处理期间/处理后肠道菌群的动态变化。抗生素的使用不仅降低了粪便微生物的多样性，而且也改变了其组成。抗生素应用选择了耐药菌谱，特别是 A. muciniphila ，同时增加了其他潜在有害菌的比例，如 Escherichia coli 和 Enterococcus gallinarum 。 这些菌种与肿瘤有关，甚至与ICB治疗中患者的无反应性有关。 Probio-M9能有效恢复抗生素治疗后小鼠的肠道菌群多样性和结构。受损的肠道菌群的恢复有利于后续的抗PD -1免疫治疗。
数据显示，在小鼠肠道中最占优势之一的属是 Bacteroides ，但受抗生素和益生菌影响显著。Probio-M9提高了 Bacteroides intestinalis  和  Bacteroides xylanisolvens 的相对丰度，有利于宿主的健康。 Bacteroides testinalis 可以通过产生代谢产物或诱导IL-1β转录来增强宿主免疫，且与癌症治疗结果呈正相关。另一项研究中，拟杆菌的相对丰度被Probio-M9降低，在对ICB治疗无反应的患者中富集。因此， Probio-M9可能对不同的结肠拟杆菌种类有不同的调控作用。 值得注意的是，添加Probio-M9后， P. disasonis 和 B. pseudolonggum 的丰度显著增加。 P. disasonis 与抗肿瘤免疫治疗的有效性相关，并被认为是联合ICB治疗的预测指标，而 B. pseudolonggum 可以通过代谢产物的产生增强免疫治疗反应。在抗PD-1治疗的荷瘤小鼠中给予Probio-M9，通过增强有益菌抑制有害菌，可以促进抗肿瘤免疫应答。
由于抗生素和益生菌的作用改变了小鼠的肠道菌群，接受抗PD -1治疗小鼠的功能宏基因组也被调节。CT组的功能宏基因组与两组非益生菌治疗组不同。Probio-M9富集糖降解相关途径（如糖酵解和Entner-Doudoroff途径、磷酸戊糖途径、甘露聚糖降解途径）、维生素和氨基酸合成途径（如8-氨基-7-氧壬酸盐生物合成I、生物素生物合成I、L-isoleucine生物合成IV）。这些功能变化通过调节能量代谢和产生维生素B7等有益代谢产物来提高和维持宿主免疫力。 宏基因组功能潜力的调节，特别是上述途径，可能是益生菌增强宿主免疫从而提高抗PD -1免疫治疗效果的另一种机制 （图6）。
然而本研究也有一定的局限性。Probio-M9调节免疫系统和协同ICB治疗的机制主要来自于分类学和功能宏基因组学分析；因此， 这里得出的结论在很大程度上是观察性的，在这个阶段仍然是假定的。应设计更精细的实验来解析和阐明益生菌作用的生理和分子机制。 此外，益生菌使用的安全性以及任何其他新产品/管理策略的安全性都是最重要的。虽然单靠摄入益生菌不太可能使患者肠道菌群组成剧烈变化，但改善的效果确实依赖于益生菌对患者肠道菌群及其功能的调节作用。即使本研究的结果可以作为临床前证据支持辅助使用益生菌ICB治疗，在将这种治疗方法应用于常规临床实践之前，仍需要进行充分的随机对照试验和安全性评估。
图6 提出益生菌Probio-M9协同抗肿瘤作用的机制，通过改善抗生素破坏的肠道菌群抗PD-1治疗。红线和蓝线分别表示抗生素或Probio-M9对之前被抗生素或Probio-M9调节的肠道微生物群的影响。绿线表示抗PD-1治疗的抗肿瘤活性。箭头和钝端分别表示促进和抑制作用（原文中图5）。

结论

本研究使用抗生素破坏小鼠的肠道菌群，用益生菌或天然方法修复后进行肿瘤移植，随后以抗PD-1为基础的抗肿瘤治疗。在实验的不同阶段监测粪便宏基因组的变化及抑瘤效果，可以发现 Probio-M9与ICB治疗协同作用，显著抑制了肿瘤，还能有效恢复被抗生素破坏的粪便微生物群 。因此，在不可避免使用抗生素后补充益生菌可有效改善ICB治疗的结果和反应性，Probio-M9可作为未来基于微生物协同肿瘤治疗研究的候选菌株。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.772532/full
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