中山大学汪善全团队ES&T：通过脱卤种群互作关系与生态位调控实现卤代烯烃污染场地高效原位生物修复

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成果简介

近日，中山大学环境科学与工程学院汪善全团队在环境领域重要学术期刊Environmental Science & Technology上发表了题为“Improve niche colonization and microbial interactions for organohalide-respiring-bacteria-mediated remediation of chloroethenes-contaminated sites”的研究论文。该研究基于生态学原理（Priority Effects及Coexistence Theory）开发了“暖场、调峰、殖菌”三个策略来提升卤代有机物转化关键功能微生物“脱卤呼吸菌”的场地环境定殖能力，并在实验室条件下完成概念验证后，进一步成功应用于两个卤代烯烃（一氯乙烯/VC及三氯乙烯/TCE）2000 m ³ 污染场地的高效生物修复；同时，本研究完成了难培养脱卤菌的吨级规模菌剂放大生产，保障了场地修复应用的菌剂需求。本研究提出的修复策略也可用于其它卤代有机物污染场地的原位生物修复 。

氯乙烯污染场地的高效生物修复很大程度上取决于生长条件要求苛刻的专性脱卤呼吸菌（OHRB）的成功定殖。而脱卤菌成功且稳定的定殖又依赖于污染场地合适的生态位条件和有利的种群互作关系。基于此，本研究根据优先效应（Priority Effects）和群落共存理论（Coexistence Theory）这两个生态学原理开发了三个策略（生态位预备/暖场、错峰发酵/调峰、增大脱卤菌剂接种比例/殖菌）来促进脱卤菌在污染场地的成功稳定定殖，从而实现氯乙烯污染场地的高效修复。本研究首先在实验室条件下基于优先效应调控生态位机制开发了微生境预备技术，通过提前接种生态位预备菌剂（NPC），为脱卤菌在复杂土壤/地下水环境中构建厌氧生境并提供脱卤菌不能合成的生长因子，促进脱卤菌的定殖能力和还原脱氯活性；再基于群落共存理论，通过错峰发酵及增大脱卤菌接种比例两种途径，调节脱卤菌与其它功能种群间的互作关系，促进脱卤菌的竞争优势及高效定殖；最后基于上述实验室优化条件开展一氯乙烯（~0.04 mM, 2000 m ³ ）及三氯乙烯（0.3-1.4 mM, 180 m ³ ）两个污染场地的原位修复应用，它们的去除率分别在3个月及5个月之后达到99.7%及96.6%；与已有场地生物修复效果相比，本研究由于突破了菌剂放大生产局限，在修复周期及修复效果方面都具有明显优势 。

引言

卤代烯烃（如四氯乙烯/PCE和三氯乙烯/TCE）被大量生产并广泛应用于工农业，造成严重的环境污染。相对目前流行的热脱附修复方法，生物修复具有经济、环保等优势，从而成为最具应用潜力的修复技术之一。卤代烯烃污染环境的生物修复主要通过脱卤呼吸菌/OHRB的还原脱氯呼吸过程实现完全脱卤，达到无害化处理的目的。但由于OHRB对生长环境要求苛刻、生长缓慢、易受种群互作关系影响等特征，基于OHRB的原位生物修复面临巨大挑战。目前已有的原位生物修复技术主要包括生物刺激和/或生物强化，通过向污染场地添加营养物质和/或功能微生物促进污染物的去除。生物刺激过程中，向污染场地添加的生物刺激材料不仅促进了脱卤菌，也无差别促进了脱卤菌竞争种群的生长，从而反向抑制了脱卤菌活性，最终导致修复周期长、脱卤不完全并产生有毒中间产物累积等常见问题。因此，本研究基于生态学理论的优先效应通过生态位预备作用为脱卤菌构建了适宜的生态位条件，再基于群落共存理论通过错峰发酵和增大脱卤菌接种比例调控脱卤菌与其它种群互作关系，促进了脱卤菌的竞争优势，使脱卤菌在污染场地能够稳定定殖并发挥长效脱氯活性，从而实现高效原位修复 。

一、生态位预备

在实验室条件下设置了6组实验来探究生态位预备作用在模拟土壤/地下水微氧条件下对脱卤菌活性的促进作用及机制，分别为4组提前接种生态位预备菌剂（NPC）不同时间（0/4/11/18天）再接种脱卤菌剂（CE40）及2组对照实验（只接种CE40或NPC）。结果表明通过生态位预备都能实现TCE到乙烯的完全脱氯，并且生态位预备最佳时间为4天。而生态位预备时间过长（11或18天），会降低脱氯速率，延长完全脱氯周期（图1）。值得注意的是，只接种脱卤菌剂CE40的对照组没有出现脱氯活性。因此，生态位预备能为脱卤菌构建了严格厌氧环境，并提供了脱卤菌所需的生长因子，产生优先效应，促进脱卤菌的快速定殖和生长。同时，生态位预备增大了脱卤菌的生态位宽度，使脱卤菌具有更强的环境适应性和稳定生存能力（图2） 。

二、调控种群关系强化脱卤菌定殖

脱卤微生物组中，脱卤菌互作种群的过度生长会对脱卤菌产生抑制作用。因此，本实验通过在生态位预备及脱卤两个阶段碳源分配比例（100%-0；50%-50%；0-100%）的调节，实现错峰发酵来平衡脱卤菌与发酵菌及产甲烷菌等脱卤互作种群间的竞争-合作关系，从而在保障这些种群协助脱卤菌生长的前提下，减少它们对脱卤菌的竞争/抑制作用。实验结果发现，通过将碳源分为两次（50-50；接种NPC时加一半碳源，接种CE40时再添加另一半碳源）投加可以最大化脱卤菌的修复效率（图3） 。

为了进一步增强脱卤菌竞争优势并探究脱卤菌成功定殖的关键接种比例，本研究比较了不同脱卤菌剂接种比例（0，0.05%，0.1%，0.5%，2.5%，5.0%）的影响。结果表明，增大脱卤菌剂接种比例从0.05%至5.0%，脱氯速率增大；并且接种比例低于0.1%时，TCE只能被还原脱氯为 cis -DCE，说明0.1%的接种比例是本研究中脱卤菌具备完全脱氯的最低接种比例。微生物溯源分析表明，当脱卤菌剂接种比例为0.05%时，CE40菌剂对总的微生物群落贡献度小于5%。而当脱卤菌剂接种比例达到或超过0.1%时，来自于CE40的微生物群落对修复微生物组成的贡献明显增大，强化了脱卤菌的定殖能力（图4） 。

为了验证“暖场、调峰、殖菌”修复策略对于实际氯乙烯污染场地的修复效果，本研究首先在较高浓度的TCE/DCE污染场地进行小试规模的修复应用验证。基于实验室优化条件，我们预先加注助剂材料，调节污染场地pH，再接种NPC菌剂进行生态位预备，待检测到持续增长的甲烷浓度和氧化还原电位降低至-310 mV左右再接种CE40，通过取样分析氯乙烯脱卤及脱卤菌生长情况。结果显示加注井中氯乙烯（TCE, 1.0 mM; DCE, 0.5 mM）在经过140天修复周期后，实现完全脱氯至乙烯，并伴随着脱卤菌丰度从0.5 × 10 ⁶ 至3.5 × 10 ⁶ 拷贝数/毫升的增长。同样，监测井#1（TCE, 0.3 mM; DCE, 0.1 mM）和#2（0.01 mM; DCE, 0.5 mM）也分别在105天和84天后实现完全脱氯，三口井的TCE平均去除氯为96.6%（图5）。而对照井中氯乙烯的浓度和脱卤菌丰度都没有出现明显的变化。

为了进一步验证上述策略在工程规模（2000 m ³ ）氯乙烯污染场地的修复效果，本研究在VC污染场地进行了进一步的修复应用验证。相较于TCE/DCE污染场地的高浓度（0.3-1.4 mM）和低温度（~15℃），VC污染场地浓度更低（~0.04 mM）、温度更高（~30℃）。结果显示，VC污染场地监测井#1和#2在经过89天后分别达到99.7%和94.6%的去除率；同时，脱卤菌丰度分别从0.7 × 10 ⁶ 和0.4 × 10 ⁶ 增至2.6 × 10 ⁶ 和1.4 × 10 ⁶ 拷贝数/毫升（图6）。上述修复应用结果表明基于生态学理论（优先效应和群落共存理论）开发的“暖场、调峰、殖菌”修复策略有效保障了脱卤菌在污染场地的稳定定殖和高脱卤活性，从而实现卤代烃污染场地的高效原位生物修复。

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