江南大学刘和团队CEJ：剩余污泥产酸发酵液中的氨基酸作为原位电子供体驱动微生物电合成中链脂肪酸

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近日，江南大学环境与土木工程学院刘和教授团队在《Chemical Engineering Journal》上发表了题为“Amino acids as in-situ electron donors drive medium chain fatty acids production from sludge acidogenic fermentation liquid by electro-fermentation enhancement”的研究论文。该研究以外加电压作为调节参数实现了无外源电子供体添加条件下，剩余污泥水解液经阳极产酸发酵、阴极碳链延长高效生产己酸，并通过底物转化和电子平衡分析发现了污泥产酸发酵液中残留的氨基酸可以作为原位电子供体驱动碳链延长反应。该技术有望为污泥等有机固废碳链延长生产中链脂肪酸提供新的理论依据和技术方案 。

利用有机废弃物生产中链脂肪酸（MCFAs）是近年来的热点研究领域，由于中链脂肪酸具有广泛的应用领域，附加值高，且易于分离等特点，因此该领域受到越来越多研究者的关注。但是利用碳链延长技术实现MCFAs的合成通常需要补充大量的外源化学电子供体（如乙醇），这极大提高了生产成本。

本文探讨了利用剩余污泥产酸发酵液中的氨基酸作为电子供体的可行性，并提出了一种阳极产酸发酵和阴极发酵进行碳链延长的两阶段电发酵工艺，以实现无外源电子供体条件下己酸的高效生产。结果表明剩余污泥水解液经阳极产酸发酵后，发酵液中乙酸和丁酸为主要产物，并残留了部分未酸化的蛋白质和氨基酸。经开路和0.9 V电压下阴极碳链延长发酵后，发现这部分残留的氨基酸会进一步被消耗，并驱动乙酸、丁酸向己酸的转化，且电压对该过程具有强化作用，氨基酸和有机酸的纯底物实验也验证了氨基酸作为原位电子供体的可行性。微生物群落结构和功能预测等分析揭示了该过程主要由阴极液中的有机物降解微生物和生物膜上的碳链延长微生物协同完成。因此，本文为缓解有机废弃物生产MCFAs对外源化学电子供体的高度依赖提供了一种新的技术方案。

活性污泥法在污水处理厂的广泛应用导致了大量剩余污泥（WAS）的产生，有效减少WAS并实现资源回收对于污水处理厂的可持续发展至关重要。近年来，利用厌氧微生物代谢从WAS等有机废弃物中生产MCFAs被认为是一种具有潜力的解决方案。WAS向MCFAs的转化主要分为两个阶段，首先是WAS通过水解、酸化为短链脂肪酸（SCFAs），然后SCFAs作为碳骨架和电子受体，通过逆β氧化和/或脂肪酸生物合成途径延长为MCFAs。研究表明，第二阶段的碳链延长反应需要电子供体的参加，以提供乙酰辅酶A作为延伸因子，并为碳链延长微生物提供还原当量。因此，先前研究在WAS生产MCFAs过程中会外源补充乙醇等作为外源电子供体，然而，这也极大提高了该技术的运行成本。基于此，电发酵技术被认为可以通过电极作为电子来源来取代外源化学电子供体，将有可能实现无外源电子供体添加下WAS向MCFAs的转化。同时，考虑到WAS经产酸发酵后，通常产酸发酵液中会残留部分未完全酸化的有机物，蛋白质作为WAS的主要组成，其水解产物氨基酸将大量存在。由于氨基酸种类多样，且具有不同的氧化还原特征，被证明在各种合成代谢中可以提供乙酰辅酶A参与有机物生产。然而，先前研究通常忽视了产酸发酵液中残留氨基酸对碳链延长代谢的影响。因此，本文通过构建两阶段的电发酵过程，分别实现WAS的产酸发酵和碳链延长发酵，并探究了氨基酸作为原位电子供体驱动MCFAs生产的可行性及其驱动碳链延长反应的机制。

图文导读

（1）两阶段电发酵工艺的构建

如图1所示，本文结合碳链延长反应的原理，提出两阶段的电发酵工艺：首先对WAS进行热碱预处理，以获得WAS水解液，由于WAS水解液中有机质酸化为SCFAs主要为氧化过程，因此先在阳极对WAS水解液进行电发酵产酸以获得富含SCFAs的产酸发酵液，而SCFAs向MCFAs转化主要为还原过程，因此通过电极的极性反转，原产酸发酵液所在的阳极室自动调换为阴极室，并接种碳链延长富集物在开路和0.9 V电压下进行碳链延长发酵。

（2）阳极产酸电发酵性能

由图2可知，随着序批式阳极产酸发酵的进行，乙酸（6.9 g/L）和丁酸（4.5 g/L）积累为产酸发酵液中的主要有机酸，产物碳分布为C2（51.6 %）、C3（6.6 %）、C4（38.5 %）、C5（2.2 %）和C6（1.1 %）。可见，产酸发酵液中丰富的SCFAs保障了后续碳链延长发酵所需的碳骨架和电子受体。同时，阳极产酸发酵液中仍残留着高达3.65 g/L蛋白质和0.82 g/L总糖，表明有机底物在产酸阶段未被完全利用。因此，用于后续碳链延长发酵的产酸发酵液中除了SCFAs外，还含有大量残余有机物 。

（3）碳链延长发酵性能

如图3所示，开路和0.9 V条件下，各有机组成展现出不同的转化特征，但己酸浓度均有不同程度的增加，表明了碳链延长反应的发生。最终，己酸在两组反应器中最大浓度分别达到1.09 g/L和3.01 g/L。该结果表明在不添加外源化学电子供体的条件下，从产酸发酵液中生产MCFAs的可行性，同时电发酵促进了碳链延长性能。然而，需要进一步解析其碳链延长反应机制及电发酵的强化机理 。

（4）潜在电子供体的识别

为了识别潜在的电子供体，首先对0.9 V反应器的阴极电子效率进行了计算，发现阴极提供的电子仅占产物合成所需电子的25.5%，表明产酸发酵液中势必存在原位电子供体驱动碳链延长反应。如图4所示，两组反应器总己酸碳选择性分别为19.3%和52.2%，证实了电发酵强化了产酸发酵液中原位电子供体向MCFAs的转化。此外，两组反应器中蛋白质浓度相比产酸发酵液分别降低33.2%和66.1%，总糖浓度分别降低31.3%和82.5%。因此，上述结果表明在碳链延长发酵阶段，残留有机物会进一步被水解，然而由于碳链延长发酵过程中乙酸浓度并未增加，推断这些有机物水解中间体可能参与了MCFAs的生产 。

（5）纯底物实验验证氨基酸驱动碳链延长反应的可行性

考虑到WAS中的有机质主要为蛋白质，其水解产物氨基酸是产酸发酵液中的主要组成，因此对WAS水解液、产酸发酵液、碳链延长发酵液中的氨基酸组成进行了分析。结果表明丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）六种氨基酸作为主要氨基酸组成，可能在碳链延长发酵阶段发挥了电子供体的作用。如图5所示，在开路和0.9 V条件下，通过不同的纯底物组合实验验证了氨基酸作为原位电子供体的可行性。结果表明氨基酸可以驱动乙酸、丁酸向己酸的转化，并证实了电发酵可以促进该反应过程，但不能直接催化SCFAs或者氨基酸转化为MCFAs 。

（6）电发酵强化机制解析

图6表明在电场的作用下，碳链延长发酵过程中阴极液的pH变化相对开路对照更加稳定，这有利于维持碳链延长微生物的活性。通过对碳链延长生物膜的循环伏安曲线分析进一步证明了电场增强了生物膜的氧化还原性能，这有利于提高碳链延长微生物催化活性。微生物群落结构揭示了上述增加机制得益于电压调控了阴极液中有机物降解者（ Pseudomonas ）和生物膜上碳链延长微生物（ Clostridium_sensu_stricto_12 ）的富集。

综上，图 7 总结了 WAS 水解液中的原位电子供体驱动有机废弃物生产 MCFAs 的机制。首先，在产酸发酵过程中，部分大分子有机物通过水解和酸化为 SCFAs ，而一些未分解的蛋白质、糖和氨基酸等仍残留在产酸发酵液中。随后，在碳链延长发酵过程中，这部分残留的有机物进一步被水解，其水解中间体可以通过有机物降解者的一些已知的代谢途径（如糖酵解、 Stick-land 反应等）产生丙酮酸、乙酰辅酶 A 和能量，从而取代外源化学电子供体的氧化途径。最终这些途径了耦合了碳链延长微生物的逆 β 途径和或脂肪酸生物合成途径，实现了 MCFAs 的生产。

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