西湖大学鞠峰组与瑞士EAWAG合作ISME：揭示污水处理厂出水对不同河流生境抗生素耐药组的差异影响

原题 ：Differential effects of wastewater treatment plant effluents on the antibiotic resistomes of diverse river habitats

译名： 污水处理厂出水对不同河流生境抗生素耐药组的差异影响

通讯作者: Feng Ju, Helmut Bürgmann

研究机构: 西湖大学工学院浙江省海岸带环境与资源研究重点实验室；瑞士联邦水科学与技术研究中心 (Eawag)

期刊： The ISME Journal 

时间:  2023

微生物抗药性（AMR）是人类公共健康的重要威胁之一。越来越多的研究表明，污水处理厂（WWTP）是河流中抗生素耐药基因（ARGs）的主要来源 [1]；然而，我们对污水排放对于不同河流生境的影响、以及ARGs在河流生态系统中的积累和富集的认识还非常有限。通过对四种河流生境（水、悬浮颗粒、沉积物、附着生物膜）和水生动物肠道微生物抗生素耐药组的宏基因组调查，本研究系统地评估了污水处理厂出水对下游栖息地微生物群落和抗生素耐药组的影响 [2]。研究结果为监测河流生态系统中的AMR 污染以及制定公共卫生基础设施质量标准提供了有力的科学支撑。

采样与理化分析

在2017 年 7 月至 10 月期间，对9个瑞士污水处理厂和受纳河流的进行采样，包括河水、沉积物、附着在岩石上的生物膜和钩虾肠道样本（图1）。采样地点包括污水处理厂污水排放点上游 130-1200 米（US）、下游 130-1200 米（D1）和下游 800-1500 米（DS）处，污水来自上述污水处理厂出水（EF）。现场测量水质理化参数包括水温、pH 值、溶解氧和电导率；在实验室测定水样中溶解的硫酸盐和氯离子。

样本处理与DNA 提取

通过 5.0 μm 孔径的过滤器过滤水获得颗粒相关微生物生物量（PA）；在此基础上，再次通过 0.22 μm的过滤器得到自由浮游微生物细胞生物量（FL）。从淡水片足类动物肠道获得生物量，沉积物和生物样品在 16,000 g 转速下离心 5 分钟并去除上清液。对不同样本进行DNA提取后，使用 NanoDrop One鉴定 DNA 浓度和纯度。

测序与生信分析

在对原始宏基因组测序数据进行质控后，使用 ARG-OAP v2.0 对 ARG 进行注释。通过16S rRNA 基因丰度的归一化计算基因相对丰度（即16S rRNA 基因的基因拷贝数）。同时以扩增子测序变异体（amplicon sequence variants, ASVs）为单位进行了扩增子测序分析，并将 ASV 与每个样本获得的总读数进行归一化处理，以获得其相对丰度。

统计分析与可视化

研究采用 Kruskal-Wallis秩和检验和配对的Wilcoxon检验或未配对的秩和检验，分析不同采样地点（US、EF、D1 和 DS）或不同生境之间 ARG的显著差异。通过相似性分析（ANOSIM）检测不同样本ARG组成的差异。所有多变量统计分析均使用 R 软件包 Vegan。

图1： 本研究共在瑞士 9 个向河流排放污水的污水处理厂进行取样。 US、EF、D1和DS分别表示上游、污水、下游 130-1200 米和下游 800-1500 米的采样点。

不同河流生境的耐药组存在显著差异

根据 ARG-OAP 2.0 与 SARG数据库的注释，作者从165个宏基因组中鉴别出21 种耐药类型中的 677 个 ARG 亚型。在河流生境中，颗粒相关生物量和片足类肠道微生物的 ARG Shannon指数最高，显著高于生物膜和沉积物（图 2A）。此外，在所有生境中，污水处理厂出水中 ARG的Shannon指数都明显高于其他地点（US、D1、DS），这表明不同生境对ARG的多样性有一定影响。ANOSIM 分析表明，不同生境具有独特的耐药组组成，尤其是片足类（例如钩虾）肠道耐药组与其他生境的差异很大（图 2b）。这表明，从底栖食物来源的微生物群到淡水片足类肠道微生物群的转变中，耐药组的组成发生了显著变化。此外，下游水域的耐药组与污水厂出水耐药组最相似，因此在所有生境中，污水排放对河水的影响最为显著。

图2： 河流生境抗生素耐药组的alpha和beta多样性分析。 A 污水处理厂出水和河流生境中 ARGs 的Shannon指数（FL：浮游微生物部分，PA：颗粒相关部分）。字母相同（即 a 或 b 或 c）的生境在统计上没有差异。B 河流各部分（水体、生物膜、沉积物和钩虾肠道）和污水处理厂出水耐药组的NMDS分析。

与NMDS排序有显著相关的ARG 亚型有165 种，通过热图可视化，作者发现不同生境的ARG类型和丰度存在明显差异（图 3）。一些 ARG 仅在钩虾肠道样本中丰度较高，比如 TEM 基因（如 TEM-1/205/117 和广谱β-内酰胺酶 TEM-118）、OXA-60、 ahph(3’)-Ⅱb、floR、vanG、arr、vanR 等；而其他一些 ARGs（如 aadA 、OXA-9/10/147、 CfxA2、sul1 和 tet39/Q/O ）在污水出水相关样本中相对丰度较高。导致OXA 基因在污水样本中相对丰度较高的原因之一可能是在污水处理过程中存在多种强大驱动因素（如各种抗生素）对OXA基因进行选择。然而，有一个例外是OXA-60 基因在钩虾肠道中的丰度高于其他生境，且其丰度变化与TEM 基因相似（图 3）。普遍认为OXA-60基因位于染色体上，因此与其他可移动的 OXA 基因相比，OXA-60 可能会经历不同的生态选择过程。需要进行基因组组装研究以进一步评估 OXA 与 I类整合子基因的共定位。

此外， 19 个 ARG 类别中的 12 个颗粒相关水体微生物量中的相对丰度明显高于自由浮游微生物（图 4a）。由于与颗粒相关微生物通常以聚集体（如絮体或生物膜碎片）的形式存在，这可能会促进细胞间的生物化学和基因交流（如水平基因转移），增加 ARG的正向选择。此外，由于颗粒相关和自由浮游的微生物群落组成不同，这种差异也可能导致抗生素耐药组的差异。

耐药组与微生物组在结构上具有相关性

为了检验微生物群落组成本身是否是不同生境耐药组差异的关键因素，作者进行Procrustes 分析以探索耐药组和微生物组之间的相互联系。结果表明，微生物群落的变化可能是不同河流生境耐药组变化的重要驱动因素（图5）。然而在部分样本偏差较大，如3个钩虾肠道样本和3个污水样本（图 5，见图标）。在这几个样本中，耐药组和微生物组结构相关性很低，说明微生物群落的变化并非全都与相应 ARGs 的变化相关。这些差异的原因可能是由于样本中ARGs大量转移，或者存在具有后天抗药性的克隆细菌变种。

河水的耐药组受到污水厂出水的显著影响

本研究选取的采样点上游除已知污水处理厂外没有其他污水排放点。然而污水处理厂排出的废水使受纳水体中的氯化物、硫酸盐浓度以及电导率显著增加；因此，可以假定对污水处理厂下游水体的影响主要来自当地污水处理厂出水。对于统计分析的19个ARG类型，只有部分ARG 类别的相对丰度在上下游有明显区别，且显著差别仅在河水样本中观察到（图 4b）。其中，对磺胺类耐药基因的影响最为明显；在β-内酰胺类抗生素耐药基因方面，只有颗粒相关部分的差异显著。此外，氨基糖苷类和三甲氧苄氨嘧啶类耐药基因在出水中的相对丰度明显高于上游，但对下游 130-1200 米（D1）的影响并不显著。

对于在统计学上有显著影响的类别，作者进一步研究了各类别中每种ARG亚型在不同地点的差异。其中，12 种亚型（ aac(6’)-II、adA、aph(6)-I、OXA-2、-10、-12、-20、-119、-129、-147、 A 类 beta-内酰胺酶抗性基因和 sul1）在不同地点的颗粒相关微生物的相对丰度存在显著差异；6 个亚型（ aac(6′)-II、aadA、bacA、bcrA、ksgA 和 sul1 ）在自由浮游细菌中存在显著差异；OXA-2在沉积物中存在显著差异。

在一些 ARG 亚型中观察到了污水对下游水样的显著影响，如在颗粒相关细菌和自由浮游细菌中观察到了 1 个氨基糖苷类（ aadA ）、1 个磺胺类（ sul1 ）和 1 个 beta-内酰胺类抗生素耐药基因（A 类 beta-内酰胺酶基因）（图 6）。与上游水域相比，这些基因在污水中的相对丰度也很高。这可能是由于未经处理的废水中含有大量的 aadA、sul1 和 A 类 β-内酰胺酶基因，也可能是由于在废水处理过程中这些基因有所增加。这些结果表明， aadA、sul1 和 A 类 β-内酰胺酶基因的“共现”可作为监测河流抗生素耐药基因人为污染的有效指标。

图4：不同ARG大类在不同河流生境的相对丰度。 A 废水（EF）和河水（US、D1 和 DS）中颗粒相关（PA）和自由生活（FL）生物量中ARG的比较。B ARGs 在水、生物膜、沉积物和钩虾肠道中存在情况。

污水厂出水对河水以外的生境影响不一致

统计分析表明，上游和下游采样地点的钩虾肠道中ARG的相对丰度无明显差异（图 4b）。此外，钩虾肠道的耐药组与潜在食物源（如生物膜）耐药组并不相似。尽管该研究未观察到污水排放导致钩虾肠道中废水衍生ARG的累积或富集，水生生物的迁移可能是导致上下游差异不显著的原因之一。另外需要注意的是，与其他河流生境相比，钩虾肠道的耐药组独特性较高，且富集了如 TEM 和 OXA-60 等ARGs，这表明需要对水生生物的耐药组进行更多的研究。

与钩虾肠道类似，在沉积物和生物膜中，不同地点ARG的相对丰度也没有明显差异（图 4b）。这些结果表明，污水处理厂排放的废水并没有对下游不同河流生境的微生物群落带来全面而广泛的影响，从而部分否定了作者最初的假设。需要注意的是，该研究的统计分析主要表明，在宏基因组数据中很难检测到不同ARG类别在不同地点的一致效应；然而使用不同方法（如表型宏基因组学）能够观察到显著的影响。该研究未发现污水排放对河水以外生境影响，其原因之一可能是生活在沉积物、生物膜和水生生物肠道的细菌大多是附着生长型，在生态和进化过程的作用下，这些细菌形成了具有相互依存关系的复杂群落，从而限制了适应污水的细菌的入侵。由于宏基因组测序的局限性，不排除这些群落可能受到某些源于废水的耐药细菌（尤其是低丰度细菌）的入侵，或通过水平基因转移获得耐药基因。

该研究未发现污水排放对河水以外的生境有显著影响，但这并不意味着污水在任何情况下都不会对其他下游生境产生影响。污水排放的影响程度主要取决于两个因素：污水中污染物和耐药细菌的浓度以及出水占河流排放量的比例。此前的研究发现，未经处理的或含有医院污染物的处理废水排放可能导致河流下游生物膜和沉积物中的 ARG丰度显著增加，然而对于普通市政污水处理厂和大流量河流而言，污水排放对河水以外生境的影响相对有限。为了确定AMR污染的水生系统的卫生基础设施质量标准，还需要进一步的研究以确定导致耐药组改变的污染程度。

图5：利用 Procrustes 法分析耐药组与微生物组之间的相关性。标记了耐药组和微生物组之间存在明显差异的样品。

图6：统计筛选的不同类别ARG

在不同河流生境和地点的相对丰度。

“同一健康”背景下的河流耐药组值得进一步研究。 本研究对九条瑞士河流和四种不同河流生境宏基因组进行系统调查，发现污水处理厂的污水排放对下游河流生境尤其是水体本身的耐药组有显著影响，因此在监测河流AMR时应优先考虑“水生境”。此外研究发现某些ARG（如 TEM-1/205/117 和 OXA-60 ）在水生生物肠道微生物组中含量相对较高。此前荷兰的一项研究表明，对于一些目前广泛使用且临床特别关注的抗生素，环境储库对其耐药性的贡献相对较低。然而，对其他国家地区的不同类型的抗生素耐药性，环境储库对其产生和进化所起的作用仍未得到充分探讨，尤其是在污染水平相对较低的系统中。因此，未来的研究应关注污水排放的具有耐药选择潜力物质（如AMR和可移动遗传因子等）的长期暴露对不同河流生境微生物群落产生的长期（进化）影响。

参考文献

1.Differential effects of wastewater treatment plant effluents on the antibiotic resistomes of diverse river habitats. J Lee#, F Ju#*, K Beck, H Bürgmann* The ISME Journal, 1-10

2.Wastewater treatment plant resistomes are shaped by bacterial composition, genetic exchange, and upregulated expression in the effluent microbiomes. Feng Ju, Karin Beck, Xiaole Yin, Andreas Maccagnan, Christa S McArdell, Heinz P Singer, David R Johnson, Tong Zhang, Helmut Bürgmann*. The ISME journal 13 (2), 346-360

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