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【分析】端粒酶辅助策略用于活细胞内DNA纳米机器再生运行

时间：2022-12-22 来源： 浏览：

【分析】端粒酶辅助策略用于活细胞内DNA纳米机器再生运行

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肿瘤的发生常伴有细胞内生物标志物的异常表达，因此生物标志物的准确检测对于早期癌症诊断至关重要。然而，肿瘤细胞中大多数生物标志物的丰度极低，所以需要开发具备稳健信号放大模块的高灵敏分析平台。
核酸分子凭借其独特的可编程特性和高特异性，在构建智能生物传感器件中显示出广阔的潜力。近年来随着纳米材料的发展，由纳米材料和功能核酸组装而成的三维（3D）DNA纳米机器受到了越来越多的关注。高密度的结合和催化位点赋予了3D DNA纳米机器更高的反应活性和信号输出。通过定制纳米机器的响应模块，已经可以实现多种生物标志物的细胞内原位成像。然而，DNA纳米机器运行后对轨道的损伤会造成纳米机器进一步运行受阻，从而限制了细胞中低丰度物种检测的灵敏度。因此，在活细胞中构建自修复可再生的DNA纳米机器是一个巨大的挑战。
为了解决此问题，近日， 南京大学 的 朱俊杰 教授、 张剑荣 教授、 闵乾昊 教授等提出了一种 端粒酶激活的可再生DNA纳米机器，实现了活细胞中人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（APE1）的高灵敏原位成像。

图1. 端粒酶（TE）可激活的再生DNA纳米机器（NE-AP/NF）用于细胞内APE1成像
如图1所示，该DNA纳米机器的构建包括两个方面：首先，将轨道链TP-5R和WL双链组装到15 nm金纳米粒子上，作为纳米效应器（NE-AP）；其次，将三链燃料复合物（ABC）组装到5 nm金纳米粒子上作为纳米燃料器（NF）。当目标物APE1存在时，L链上的AP位点被切割，释放W链，进而与ABC及TP-5R发生Toehold介导的链置换反应，实现W链在轨道链上的行走及荧光信号的不断积累。同时TE识别并延伸 NE-AP/NF纳米机器的轨道链TP-5R，使得 W链在燃料链充足的情况下，可在修复延伸的轨道链上再次行走，从而实现纳米机器在细胞内的再生运行。而运行期间累积的荧光信号，可完成细胞内APE1的原位成像。

图2. TE激活NE-AP/NF纳米机器在细胞外再生运行
作者首先分析了纳米机器在细胞外的再生性能（图2a）。研究表明，TE存在时，APE1触发的NE-AP/NF纳米机器可输出更高的荧光信号及更优的信噪比（图2b、2c）。纳米机器的实时荧光监测结果表明，在TE的辅助下，NE-AP/NF纳米机器运行时间更长（图2d）。此外，无论TE是否存在，NE-AP/NF纳米机器的荧光信号与APE1浓度在0 ~ 1.0 U/mL范围内均呈现良好的线性关系，而TE存在时，NE-AP/NF纳米机器对APE1的检测灵敏度更高（图2e）。

图3. NE-AP/NF纳米机器在细胞内对APE1的响应
接下来作者选择MCF-7细胞作为模型细胞，研究了该纳米机器在活细胞中对APE1的成像效果。与对照组相比，NE-AP/NF纳米机器在细胞内可观察到明显的FAM荧光信号（图3a）。流式细胞术的统计结果与荧光成像结果一致（图3b、3c）。这证明了该纳米机器可完成细胞内APE1的特异性成像检测。

图4. NE-AP/NF纳米机器在不同细胞系内对APE1成像
最后为了探究APE1在不同细胞系中表达水平的差异，作者选择MCF-7细胞、HeLa细胞和L02细胞作为模型细胞。结果表明NE-AP/NF纳米机器在MCF-7细胞中信号输出最强，与文献报道一致（图4a）。为了进一步阐明细胞内TE的信号贡献，作者在TE-ON及TE-OFF条件下，对纳米机器的性能分别进行了评估。研究发现与TE-OFF处理的HeLa细胞相比，TE-ON处理的HeLa细胞荧光信号显著增强；在MCF-7细胞中，TE-ON条件下的荧光信号较TE-OFF条件下仅微弱增强；而L02细胞中TE-ON和TE-OFF下的信号强度几乎无差异（图4b）。TE-ON和TE-OFF条件下荧光信号强度比（ I Y /I N ）可揭示不同细胞系内TE的差异表达（图4c）。这些结果表明NE-AP/NF纳米机器可在不同细胞系中再生运行并实现不同细胞系内APE1的精确成像，此外，通过控制纳米机器的再生操作可推断TE的表达水平。
综上所述，该TE激活的可再生DNA纳米机器，将TE延伸轨道与APE1触发结合，实现了在活细胞中的再生运行，及APE1的特异性原位成像。此外，通过控制NE-AP/NF纳米机器的再生运行，该纳米机器可指示TE在不同细胞系内的差异表达。这项研究为开发更适用、更高效的DNA纳米机器提供了一种新的范式。
这一成果近期发表在 Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是南京大学博士研究生 张倩莹 。
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
A Telomerase-Assisted Strategy for Regeneration of DNA Nanomachines in Living Cells
Qianying Zhang, Yihan Wang, Wenjing Wang, Qianhao Min, Jian-Rong Zhang, and Jun-Jie Zhu
Angew. Chem. Int. Ed ., 2022 , DOI: 10.1002/anie.202213884
研究团队简介

朱俊杰： 南京大学教授/博士生导师，英国皇家化学会会士，亚太超声化学学会副主席。主要工作为纳米生物分析化学，工作涉及纳米生物电化学、纳米与生物成像、纳米材料的生物应用等。相关研究成果在 Nat. Chem., Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Mater. 等期刊上发表。入选爱思唯尔（2014~2022）中国高被引学者榜单及Web of Science跨学科全球高被引学者榜单（2018~2022）。2018年获江苏科技进步一等奖；2010年获教育部自然科学一等奖；2015年中国分析测试协会科学技术一等奖，2021年获中国化学传感器“雷磁”杰出贡献奖。兼任《 Analyst 》、《 Biosensors 》、《 Frontiers in Sensors 》、《 Current Smart materials 》和《 分析科学学报 》等杂志副主编。

https://www.x-mol.com/university/faculty/11600

张剑荣 ，南京大学教授/博士生导师，《大学化学》杂志编委。曾任南京大学教师教学发展中心专家委员会成员、国家级化学实验教学中心主任、化学实验课程国家级优秀教学团队主持人、化学化工学院教学委员会主任、南京大学赵世良讲座教授。2007年获宝钢优秀教师奖， 2018年获得国家级教学成果一等奖；2001、2005、2009年还分别获国家级教学成果二等奖。在高等教育出版社和科学出版社出版教材2本。主要工作涉及纳米电极材料制备及其在能源器件中的应用、生物分子的纳米光电传感分析、生物燃料电池及其自供能传感分析应用等。担任在科学研究方面，承担多项国家自然科学基金委项目。发表论文180余篇。2010年获教育部高等院校自然科学成果一等奖、2007年江苏省科技进步二等奖，并在2014，2018年分别获得江苏省优秀博生论文指导导师。

https://www.x-mol.com/university/faculty/11509

闵乾昊 ，南京大学教授/博士生导师，南京大学化学和生物医药创新研究院双聘PI，国家优秀青年基金获得者（2016）。2007年获南京大学理学学士学位，2012年获南京大学理学博士学位。2013-2014年赴斯坦福大学化学系从事访问学者研究（合作导师：Richard N. Zare）。主要研究方向为纳米生物分析与质谱分析，包括基于新型纳米材料的生物分离分析、生物质谱分析以及药物可控递送研究。在 Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Nano、Chem. Sci.、Anal. Chem. 等期刊发表论文40多篇。获2018年度江苏省自然科学奖一等奖（排名第四），2015年度中国分析测试协会科学技术奖一等奖（排名第四）。主持国家自然科学基金面上项目2项，重大研究计划培育项目1项。
https://www.x-mol.com/university/faculty/63208

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