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【纳米】西安交大方吉祥教授团队Nano Lett.：提出限域增强拉曼光谱新概念

时间：2023-12-28 来源： 浏览：

【纳米】西安交大方吉祥教授团队Nano Lett.：提出限域增强拉曼光谱新概念

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单分子及痕量分子水平检测是人类对物质世界认知的一贯追求。自从1974年，表面增强拉曼光谱（SERS）发现以来，到1997年， 单分子表面增强拉曼散射 （SM-SERS）现象的发现，SM-SERS技术的检测能力达到了超灵敏的单分子水平，从而受到了物理、化学和生物医学等研究者的广泛青睐。然而，经过二十余年的发展，面对目前商业化和实际应用需求，SM-SERS的超高灵敏度的优势尚未在多种分子和真实样品检测中得以充分发挥。
从SERS到SM-SERS，电磁场增强机制及热点效应一直在其理论研究方面占据主流地位。在过去的几十年里，研究人员主要关注了光-纳米结构的相互作用这一基本科学问题，通过纳米技术创造了各种类型的SERS基底并实现了对热点的调控。然而，1997年所报道的SM-SERS呈现出一种典型的“on and off”时序波动现象，这种闪烁信号行为在SM-SERS的实际应用中是非常不利的。因为，商业检测中更需要高度可重复、均匀、稳定的SERS及SM-SERS信号。
针对以上问题， 西安交通大学 生命学院 方吉祥 教授团队基于对早期SERS和SM-SERS研究的深入理解，及分子-纳米结构相互作用及相关机制的深入研究，在本工作中，该团队提出了一种 限域增强拉曼光谱（CERS）新概念及避免SM-SERS闪烁信号的新机制，在SM-SERS信号稳定性、重现性及灵敏度方面，均得到显著提升。 相关工作近日发表在 Nano Letters 上。该论文以西安交通大学生命科学与技术学院为本工作的第一作者及通讯作者单位，该研究得到了厦门大学化学化工学院 李剑锋 教授及南京大学化学与化工学院 龙亿涛 教授的帮助与支持。以上工作得到了国家自然科学基金、西安交通大学创新团队项目支持。
该方法在SERS检测过程中在银、金甚至其他等离激元纳米材料表面原位构建一个活性的封装壳层 (图1)。这种活性封装壳层可以将待测分子限域并锚定在等离激元纳米粒子表面，以避免待测分子的吸附-解吸附行为，从而避免SM-SERS光谱的闪烁信号。本工作首次在金胶体纳米粒子体系中实现对待测物的超高灵敏度、高稳定性和高信号重复性的单分子/少分子水平的检测。此外，在实际应用中，可以通过设计具有不同组分的封装壳层，使该策略广泛适用于包括生物医学诊断、催化反应机制研究等多种分子系统的SM-SERS检测。

图1. SERS和SM-SERS的传统概念以及CERS策略示意图和原位封装活化层的表征
Ag NPs和Au NPs胶体聚沉体系下CERS概念的提出
作者基于Ag NPs的SERS检测策略评估原位封装活化层的作用效果，通过优化NaCl的使用量，可以在SERS检测中实现接近单分子水平的检测限。当NaCl的使用量为100微升时，CV分子的检测限 (LOD) 达到fM水平，比NaCl过量使用时的LOD值提升了近7−8个数量级 (图2a)。如此巨大的SERS性能差异值得引起重点关注。

图2. 基于Ag NP和Au NP胶体的CV的SERS检测
针对不同NaCl使用量所对应的表面成分进行表征，可以发现，少量的NaCl只会导致Ag NPs轻微聚集，形成小的团簇，并保持原来的球形形状。过量的NaCl加剧了Ag NPs的聚集程度，且Ag NPs似乎融合并连接在一起，很难区分单个粒子。这可能是由于Ag NPs中释放出来的 Ag + 离子，与加入的NaCl形成二次析出物如AgCl，并包覆在聚集的Ag NPs表面。由此，该工作不仅揭示了1997年SM-SERS活化层的作用机制，而且该原位形成的活化层，还可以作为封装层，将待测物分子包裹、限域并锚定在活化封装层内，从而避免分子的解吸附行为。因此，作者将具有该物理过程的SERS检出新策略命名为限域增强拉曼光谱 (CERS)。
受上述发现的启发，作者将CERS的概念引入到目前商业化最为广泛使用的Au NPs体系中。将CV分子加入到Au胶体中，随后加入聚沉剂NaCl和少量AgN O 3 ，在Au NPs聚集过程中原位形成AgCl活化封装层。令人兴奋的是，在Au NPs体系中，基于CERS法检测CV的LOD可以达到pM水平 (图2b)，远优于基于溶液聚沉法测定的LOD (1 0 -8 M)。这是首次在Au NPs胶体体系中实现高稳定、高信号重现性的单/少分子水平检测。
CERS策略下Au NPs体系中单分子时间分辨拉曼光谱
为了进一步研究现有CERS策略的光谱特性，作者测试了Au胶体体系中CV分子的时间分辨拉曼光谱。作为比较，设定了三种不同的实验条件来收集时间分辨拉曼光谱，包括（1）采用没有原位封装活化层的Au NPs作为SERS衬底；（2）通过将NaCl和AgN O 3 先加入到Au NPs中，使Au NPs预先被AgCl层活化，随后加入CV分子；（3）利用CERS策略，先添加CV分子到Au NPs中，然后加入NaCl和AgN O 3 形成原位活化封装层。在没有活化封装层的条件下，信号均表现为典型的单分子行为，即随机闪烁效应 (图3a和3b)。然而，在CERS方案中，SERS信号表现出截然不同的行为，在pM的CV分子浓度下仍然可以检测到稳定的拉曼信号，而在0.1 pM浓度下无法检测到信号 (图3c)。通过缩短浓度间隔和积分时间，仍然没有检测到典型单分子SERS的闪烁信号。
本文所报道的CERS策略在SM-SERS检测中显示出非常重要的优势。长期以来，随机波动和信号闪烁被认为是SM-SERS的主要标志。当待测分子吸附在Au NPs表面或者活性层表面时，均可以发生信号闪烁行为。在这种情况下，分子在“热点”附近通过吸附与解吸附效应处于相对自由的状态，从而导致了SERS信号强度的间歇性变化。然而，这种不稳定的闪烁信号对于SM-SERS实际应用是非常不利的。图3d显示了不同条件下CV分子检测信号概率的统计数据。采用现有的CERS策略，可以获得比Au NPs体系至少低4个数量级的稳定拉曼信号。由于CV分子优先被加入到Au NPs体系中，已经吸附到Au NPs的表面，在后续的NaCl和AgN O 3 的加入过程中，沉积的AgCl可以与CV分子结合，形成CV/AgCl复合物。因此，原位形成的AgCl活化封装层通过对目标分子的吸附、限制和锚定，有效地避免了SM-SERS检测中的信号随机波动及信号闪烁，大大的提升了SERS信号的稳定性。

图3. 不同条件下Au NP体系中CV分子的时间分辨SM-SERS检测
基于CERS策略的无标记生物分子检测
为了验证CERS在生物诊断方面的应用潜力，作者利用CERS策略对单链DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA) 和miRNA进行检测。结果表明，相比于Au NPs，采用CERS策略检测dsDNA和A12及miRNA，其LOD均提升2~3个数量级 (图4)。更重要的是，与NaCl作为聚沉剂的Au NPs体系相比，CERS策略可以提高DNA的SERS信号质量，表现出明确的A、C、G三个碱基的特征峰。这很可能是由于通过原位形成AgCl活化封装层更容易使DNA分子平铺在Au表面，使碱基有更多的机会处于SERS活性高的区域，从而揭示更多的碱基信息。这些结果证明了CERS策略可以作为一种高灵敏、便携的生物分子检测技术。

图4. 基于CERS策略的无标记核酸序列检测
基于CERS策略的化学反应催化过程的原位监测
目前，对于转换效率低或催化剂表面吸附弱的催化体系，现有技术难以获得对其反应过程的动态监测。本工作中，作者利用CERS策略实现了对氨基噻吩 (4-ATP) 分子催化反应过程的动态监测，且在较低的分子浓度 ( 10 -7 M) 时 (图5)，仍然可以监测催化反应过程。CERS策略的优势也体现在对金表面的亲和力较弱及SERS灵敏度较低的探针分子的检测，如对硝基苯胺 (p-NA) 分子的原位催化反应过程。因此，在低浓度的催化分子或低转化效率的弱催化反应体系中，CERS策略所具有的超高灵敏度特性在原位监测催化过程和研究机理方面显示出广泛的应用潜力。

图5. 基于CERS策略的化学反应催化过程监测
小结
总而言之，CERS新概念的提出，不仅阐明了避免SM-SERS“闪烁”信号特征的新机制，而且首次在现有商用化的金胶体纳米颗粒体系中实现了高稳定性、高灵敏度的单分子/少分子水平的检测。因此，CERS不仅是当前商业化中广泛使用的SERS策略的改进方案，而且在无标记生物诊断、环境保护和公共安全等诸多领域也显示出良好的应用前景。
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页）：
Confined-Enhanced Raman Spectroscopy
Ruiyuan Zhang, Lingwei Li, Yu Guo, Yafei Shi, Jian-Feng Li*, Yi-Tao Long, and Jixiang Fang*
Nano Lett ., 2023 , DOI: 10.1021/acs.nanolett.3c03734

研究团队主页链接：
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