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具有抗菌活性的木质素纳米粒子的可控合成及其抗菌机理分析

时间：2023-07-07 来源： 浏览：

具有抗菌活性的木质素纳米粒子的可控合成及其抗菌机理分析

生物基能源与材料
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随着社会的发展和人类生活水平的提高，公众对健康的追求日益增强。因此，抗菌材料成为消费者长期关注的对象。现有的抗菌材料主要分为无机抗菌材料、有机抗菌材料和天然抗菌材料。其中，无机抗菌材料具有稳定性高、抗菌持续时间长等优点。不幸的是，高制备成本和延迟的抗菌活性成为其瓶颈问题。虽然有机抗菌材料具有较高的抗菌速度，但安全性低、毒性高等缺点也限制了其发展。因此，进一步研究高效低毒的抗菌材料，对于满足人类创造安全健康生活的迫切需求具有显著的社会意义。
近日， 南京林业大学戴红旗教授、徐婷婷博士 等人通过分馏和反溶剂的方式处理具有一定抗菌能力的 木质素 ，获得了不同分子量的木质素组分。同时增加了木质素活性官能团的含量并调节微观结构，从而提高了木质素的 抗菌性能 。结果表明，具有高氢键能力的丙酮可以收集不同分子量的木质素，使酚羟基含量提高到31.2%。通过调节反溶剂过程中水/溶剂的比例（v/v）和搅拌速率，可以获得形状规则、尺寸均匀的木质素纳米颗粒（球体40-300 nm）。通过观察木质素纳米颗粒在体内外共孵育不同时间后的分布，可以发现木质素纳米颗粒首先在外部破坏细菌细胞的结构完整性，然后被吞入细胞中影响其蛋白质合成，构成动态抗菌过程。
相关工作以“Controllable synthesis of lignin nanoparticles with antibacterial activity and analysis of its antibacterial mechanism”为题发表于《International Journal of Biological Macromolecules》。
/ 木质素的分馏 /
首先，作者通过设置丙酮和水的比例控制原始木质素的溶解度。分子量测定证实了分馏的可行性。当丙酮浓度达到100%时，分馏木质素的分子量最小。进一步研究表明，官能团含量的变化与分子量密切相关。从图1A–B可以看出，当丙酮浓度设置为100%时，由于可溶部分的小分子，更容易暴露更多的酚羟基。进一步通过HSQC和FTIR分析表明分馏分离后木质素的基本结构无显著变化。从HSQC谱图（图1D）可以看出，大部分多糖杂质可以通过分馏去除，为后续木质素功能研究的准确性控制提供了保障。
图 1.（A与B）分离后原料木质素和木质素的官能团含量和分子量（用GPC测定分子量）。（C）不同丙酮/水比（20%–100%）分馏后木质素的FTIR光谱。（D）不同丙酮/水比（20%–100%）分馏后的原始木质素和木质素的HSQC光谱。
/ 分馏木质素的抗菌活性 /
作者比较了不同分馏方法制备木质素的抗菌效果。图2C表明，100%丙酮浓度分馏分离得到的木质素具有最好的抗菌效果。这主要是由于通过100%丙酮浓度分馏得到的木质素具有最小的分子量，因此暴露出更活跃的官能团如酚羟基和羧基，分别增加了1.3倍和1.8倍。结果表明分馏分离可以有效地提高抗菌活性。
图 2.（A）（C）不同丙酮/水比（20%–100%）对木质素组分的金黄色葡萄球菌抑制率。（B）（C）不同丙酮/水比（20%–100%）对木质素组分的大肠杆菌抑制率。
/ 木质素纳米颗粒的表征 /
在本文中，作者通过改变搅拌速度、滴加顺序和水与丙酮的比例，发现随着搅拌速度的增加，木质素纳米颗粒的尺寸也因剪切力的增加而减小（图3A）。当有机溶剂浓度增加时，木质素纳米颗粒的尺寸呈增大趋势（图3B-C）。同样，当滴加顺序改变时，木质素纳米颗粒的尺寸变大（图3D），这与木质素分子在有机溶剂和水中的不同折叠程度有关。值得注意的是，当丙酮含量增加时，木质素纳米颗粒出现空心结构（图3E）。
为了后续实验的均匀性，作者使用木质素的最终浓度为1 mg/mL，丙酮：水（v：v）为1：9来制备木质素纳米颗粒（图3F），并使用从100%分馏中获得的木质素作为对照组。结果表明，纳米颗粒具有较好的抗菌效果。纳米粒子对金黄色葡萄球菌的抑制率可以达到100%，而分馏木质素只能达到84.7%。同样，通过制备纳米颗粒，对大肠杆菌的抑制率从95.5%提高到100%（图3G）。
图3. 木质素纳米颗粒的相关表征。
/ 最小抑菌浓度 /
作者采用CFUs方法测定木质素纳米颗粒的最小抑菌浓度。观察到随着木质素浓度的增加，固体培养基上的菌落数量逐渐减少（图4A）。当木质素浓度达到5 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率达到100%，表明分馏木质素纳米颗粒具有一定的抗菌活性，可以开发为一种天然抗菌纳米材料。
图 4.（A）丙酮分馏制备木质素纳米颗粒的最小抑菌浓度100%。（B）木质素纳米颗粒处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态变化（0 h，4 h，12 h ）。
/ 抗菌机理 /
作者从多个角度分析了木质素纳米颗粒的抗菌机制，如通过SEM研究木质素纳米颗粒处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态变化（图4）；通过检测AKP（碱性磷酸酶）的细胞外含量反映通透性变化的程度和细胞壁的破坏（图5 A）；还通过测量大分子的电导率和吸光度的变化证明木质素纳米颗粒对细菌细胞膜具有影响（图5B、C）；通过荧光光谱研究了木质素纳米颗粒对细菌膜蛋白的破坏（图6）；最后通过TEM观察研究了木质素纳米颗粒在细菌中的分布，证实木质素纳米颗粒可以通过破坏细菌细胞膜和细胞壁导致大量内容物泄漏出来，最终杀死细菌（图7）。
图 5.（A）用木质素纳米颗粒处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在不同时间点的细胞外碱性磷酸酶活性。（B）用木质素纳米颗粒处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在不同时间点的电导率。（C）用木质素纳米颗粒处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在不同时间点在260nm处的吸光度。
图 6.木质素颗粒对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌膜蛋白在λex 280 nm和λex 296 nm处荧光强度的影响。
图 7.（A）用相同浓度（5 mg/mL）的木质素纳米颗粒处理不同时间的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的TEM图像。（B ）用木质素纳米颗粒处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌可溶性细胞蛋白的SDS-PAGE模式。
/ 总结 /
在本文中，作者采用丙酮收集不同分子量的木质素，有效降低了木质素的多分散系数，使木质素中苯酚羟基的含量从23.46 %提高到31.2%。在此基础上，通过反溶剂法从分馏得到的木质素中制备了形貌和尺寸可控的纳米颗粒。在制备过程中，反应参数对纳米颗粒的形貌和尺寸有重要影响。粒径和混合速度成反比，有机溶剂的比例控制着纳米颗粒的形貌。通过观察木质素纳米颗粒在体内外共孵育不同时间后的分布，可以发现木质素纳米颗粒首先在外部破坏细菌细胞的结构完整性，然后被吞入细胞中影响其蛋白质合成，构成动态抗菌过程。本研究旨在为开发绿色安全的生物质抗菌纳米材料提供理论指导，并为木质素材料的高值化利用提供新的方向。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.125596

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