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Neuro-Oncology | 天津医科大学康春生团队发现新的小分子，逆转替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤的耐药

时间：2023-10-11 来源：浏览：

Neuro-Oncology | 天津医科大学康春生团队发现新的小分子，逆转替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤的耐药

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2023年8月31日，天津医科大学总医院、天津市神经病学研究所康春生教授课题组在神经肿瘤学知名期刊 Neuro-Oncology （影响因子15.9，中科院1区，JCR 1区）发表题为“ EPIC-1042 as a potent PTRF/Cavin1–caveolin-1 interaction inhibitor to induce PARP1 autophagic degradation and suppress temozolomide efflux for glioblastoma Get access Arrow ”的研究论文，该研究发现了 一种新型小分子化合物EPIC-1042通过促进胶质母细胞瘤PARP1自噬性降解和抑制细胞内TMZ外流逆转替莫唑胺耐药。

基因组不稳定性是癌细胞的病理标志，通常是由DNA损伤应答（DDR）通路异常所引起的。 DDR失调在肿瘤发生中起着双刃剑的作用，一方面能够改变基因组的稳定性，另一方面可以用于优化传统细胞毒性治疗和开发DDR抑制剂。 因此，DDR通路靶向抑制剂正逐步发展，以克服化疗耐药的临床挑战，并加强传统化疗的疗效。

脑胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，突出特点是恶性进展迅速、对放化疗不敏感、复发率和致死率高、预后很差。 目前替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是唯一的临床治疗化疗药，但TMZ耐药问题日益突出，显著限制了TMZ的临床疗效。TMZ以原药形式进入细胞以后，经过两次代谢生成重氮甲烷，从而对DNA造成损伤。TMZ甲基化核苷酸以N7-甲基鸟嘌呤(N7-methylguanine, N ⁷ MeG)和N3-甲基腺嘌呤(N ³ -methyladenine, N3MeA)为主，分别占70%和9%，并可被碱基切除修复(base-excision repair, BER)途径有效清除，而PARP1在BER途径中起关键作用。虽然O6-甲基鸟嘌呤(O6-methylguanine, O ⁶ MeG)加合物约占烷化DNA产物的5%，但是会导致O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-6-Methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）缺陷癌细胞的持久DNA损伤。 肿瘤细胞内存在的碱基切除修复机制，以及MGMT的表达促进了烷基化DNA的修复，从而导致TMZ耐药。

重要的是，通过计算机辅助药物设计(CADD)和机器学习(ML)开发高效和最低细胞毒性小分子抑制剂(SMIs)来治疗胶质母细胞瘤（GBM）的新时代已经出现。 证据支持PARP1缺陷损害BER途径不仅降低PARylation水平，还增加脊索瘤细胞对TMZ的敏感性。 因此，在CADD指导下设计新型小分子抑制剂，直接或间接地抑制BER通路和/或MGMT表达，可能会提高TMZ治疗的疗效。

小凹，一种纳米级(60-80纳米)杯状内陷的质膜，其特点是含有丰富的小凹蛋白，并在内吞、胆固醇脂质代谢以及信号转导过程中发挥重要作用。与小窝蛋白家族的其他成员相比，小窝蛋白-1 (caveolin-1, CAV1)是小窝的主要成分，驱动小窝的形成并在各种组织中表达。此外，聚合酶I和转录释放因子(PTRF)，也称为Cavin1，在胆固醇和磷酯酰丝氨酸存在的情况下能够被CAV1募集至质膜，对于小凹的形成和功能至关重要。我们之前的研究已经证明PTRF-CAV1复合体能够以小凹依赖的方式被装载至小细胞外囊泡中（sEVs），并在sEVs的形成、转运和分泌过程中发挥重要的作用。此外，PTRF与CAV1结合的增加可以增加小凹的数量，促进sEVs的产生和摄取。有趣的是，sEVs可以作为膜包埋药物外排泵转移和抗癌药物外排的载体。我们之前的研究也已经证明PTRF敲除(KO)抑制了PTRF-CAV1的复合物形成、小凹形成以及sEVs的产生，从而提高了GBM细胞内TMZ的浓度。

自噬是受损蛋白质和细胞器降解及其成分再循环的过程。因此，它是对抗刺激的重要保护机制之一。越来越多的证据表明，TMZ治疗可诱导细胞自噬，以支持细胞内生存所需的能量的增加，因此这也是GBM对TMZ耐药的原因之一。此外，联合二磷酸氯喹(CQ)、ATG4B抑制剂或ATG5敲低(KD)已被证明可抑制自噬并增强TMZ对GBM的疗效。p62是一种经典的自噬受体，利用其碳端泛素相关(UBA)结构域与泛素化的货物相结合，并通过LC3相互作用区(LIR)与微管相关蛋白1轻链3-II (LC3-II)结合，从而将货物固定在自噬体的内膜上降解。值得注意的是，在接受舒尼替尼治疗的肺癌中，p62可选择性地调控细胞中PD-L1的净含量。此外，其他几项研究也表明了PTRF和CAV1在调节自噬中发挥关键的作用。然而，对于小凹形成至关重要的PTRF和CAV1之间的相互作用是否会影响自噬尚不清楚。

在这项研究中，本课题组发现EPIC-1042能够破坏PTRF和CAV1之间的相互作用；通过抑制sEVs分泌增加细胞内TMZ浓度；在药物作用早期通过增加p62与PARP1的结合，促进PARP1的自噬降解并在药物作用后期抑制自噬流。通过以上机制EPIC-1042增强了胶质母细胞瘤对TMZ的敏感性。本研究为EPIC-1042联合TMZ治疗GBM提供了一种新的治疗策略。

图一，EPIC-1042能有效阻断PTRF和CAV1结合，抑制sEVs外排并且升高细胞内替莫唑胺浓度。

基于PTRF-CAV1互作深度解析和分子动力学模拟（图1A）以及基于受体的虚拟筛选（RBVS）（图1B），课题组筛选出评分最高药效最好的候选小分子药物EPIC-1042。为验证EPIC-1042的阻断效果，首先将生物素（Biotin）偶联至EPIC-1042 （E-Biotin）来证明EPIC-1042是否能够和PTRF结合。Pull-down结果显示E-Biotin处理后，内源性PTRF和外源性表达的PTRF-eGFP均被链霉亲和素磁珠结合。而非生物素化的EPIC-1042组未检测到信号，也表明生物素-链霉亲和素相互作用具有特异性（图1C）。进一步使用抗PTRF的抗体进行了Co-IP检测，发现与DMSO处理相比，EPIC-1042处理后几乎检测不到与PTRF和PTRF-eGFP结合的CAV1（图1D）。因此，EPIC-1042能与PTRF结合并有效地阻断PTRF-CAV1相互作用，且具有高对接评分和最佳的增殖抑制作用。

本课题组使用术语“sEVs”来指代从条件培养基中通过超速离心法(100,000g)获得的沉淀。首先，我们量化了sEVs中的总蛋白含量，结果显示，与DMSO处理的细胞相比，EPIC-1042处理后的sEVs中总蛋白含量明显减少（图1E）。为了进一步分析不同的亚型，用免疫印迹分析了sEVs和全细胞裂解物(WCL)中具有普遍特征的外泌体标记物（图1F）。结果显示：在sEVs和WCL中都显著存在Alix、CD63、Tsg101和CD9，然而在sEVs中很少检测到calnexin，即外泌体排除的内质网蛋白，这表明sEVs中的外泌体纯度很高。当sEVs从等量的细胞中离心时，外泌体标记物的强度反映了sEVs的数量。EPIC-1042处理显著降低了sEVs中Alix、Tsg101和CD9标记物的数量，但在WCL中没有。此外，CD63，作为直接产生外泌体的多泡体(MVBs)的标志物，也显示出同样的趋势。这些结果表明，EPIC-1042可能损害了sEVs的分泌，而不是影响标记蛋白的表达。

接着Nanosight分析一致显示EPIC-1042处理后，超速离心沉淀中颗粒数量显著减少，并且EPIC-1042不仅仅导致超速离心下来的沉淀减少，而且是sEVs的实际减少（图1G-H）。最后，正如我们预期的那样，TMZ和EPIC-1042联合使用的方案显示：细胞内TMZ浓度大约是单独使用TMZ处理TBD-0220细胞的两倍（图1I）,且sEVs中TMZ浓度降低。综上所述，EPIC-1042可以通过破坏PTRF与CAV1的相互作用来特异性抑制sEVs的分泌。

图二，EPIC-042能抑制自噬流并在MGMT缺乏的GBM体内实验中增敏替莫唑胺。

由于MVB起源于早期内体膜的内陷，MVB的升高可能是由于MVB生物生成的增加或运输和降解的减少。首先，EPIC-1042治疗后，早期内体标志物早期内体抗原1 (early endosome antigen 1, EEA1)呈剂量依赖性和时间依赖性下降趋势（图中未展示）。MVBs与自噬体融合形成两相体进行降解是内吞系统和自噬系统的交汇点；此外，甲基-β-环糊精(MBCD)介导的膜结合胆固醇的消耗和脂筏的破坏已被证明可诱导小鼠胚胎成纤维细胞中自噬流的发生，而小凹也是脂筏的一种。因此，本课题组测试了EPIC-1042对自噬的影响。发现EPIC-1042能够使p62和自噬体标志物LC3-Ⅱ以时间和剂量依赖的方式升高（图2A-B）。LC3-Ⅱ水平的升高可能是由于自噬体形成增多或蛋白质降解过程受到抑制。为了区分这两种可能性，首先检测了在自噬体成熟中起重要作用的关键基因：EPIC-1042处理后这些基因的总蛋白水平保持不变（图中未展示），因此排除了EPIC-1042诱导自噬的可能性。接下来，通过共聚焦成像探究了EPIC-1042对异位表达双荧光标记(GFP和RFP) LC3的影响，从而探究其对自噬流的影响。由于GFP在溶酶体酸性条件会淬灭，而RFP不会，因此RFP与GFP荧光的比值可以用来评估自噬流。免疫荧光成像显示：在EPIC-1042暴露48h后，RFP点数增加，然而RFP:GFP比率急剧下降（图2C-D）。这些结果表明：EPIC-1042可以显著抑制蛋白质的自噬降解，而不影响自噬体的发生，同时这些结果也证实产生外泌体的MVBs确实增加了。为了进一步验证EPIC-1042的这些作用，使用自噬诱导剂MTOR抑制剂雷帕霉素与EPIC-1042联合或单独处理GBM细胞，结果表明：与雷帕霉素单独处理相比，共处理诱导的LC3-Ⅱ水平更高，从而排除了EPIC-1042促进自噬体发生的可能性（图2E）。

如图2F所示，通过在裸鼠海马原位注射TBD0220细胞构建胶质瘤原位颅内模型，检测EPIC-1042是否能在体内增加TMZ敏感性。生物发光分析显示：与DMSO相比，EPIC-1042单用能轻微抑制肿瘤生长，但无显著性；EPIC-1042与TMZ联用对肿瘤负荷的减轻程度在4个治疗组中最高（图2G-H）。此外，EPIC-1042单药治疗并未显示出任何总体生存期(OS)获益，然而它增强了TMZ的疗效；而且联合治疗组的中位生存期约为TMZ单药治疗组的1.5倍（图2I）。使用抗ki67抗体的IHC分析进一步支持了这一点（图二J）。综上所述，研究结果表明EPIC-1042可以增强TMZ的体内疗效。

图三，在药物效应的早期，EPIC-1042通过p62介导PARP1的选择性自噬降解

基于体内实验结果，推测可能有其他潜在的机制调节TMZ的疗效。EPIC-1042不能通过影响MGMT增加TBD-0220和U87-MG细胞中O ⁶ MeG的数量，而可通过干扰碱基切除修复通路增加N ³ MeA和N ⁷ MeG从而提高TMZ细胞毒性，PARP1缺失可损害碱基切除修复通路。另外还发现EPIC-1042能够使PARP1蛋白水平下降（图3A），然而PAPR1的mRNA水平却没有变化（图中未展示），这表明EPIC-1042能够诱导PARP1蛋白降解。为了验证这一点，用蛋白质合成抑制剂环己亚胺(CHX)或CHX+EPIC-1042以时间依赖性的方式处理GBM细胞，免疫印迹结果显示：联合用药组的PARP1降解速度比单独用药组快（图3B-C）。鉴于自噬和泛素-蛋白酶体系统(UPS)是主要的蛋白水解系统，为了区分可能参与PARP1蛋白水平调节的系统，我们使用溶酶体抑制剂氯喹、蛋白酶体抑制剂MG132、CHX或EPIC-1042分别处理TBD-0220和U87-MG细胞系16和24小时。如图3D所示：单独用CHX处理PARP1时，PARP1被大量降解，MG132可以逆转这种效应，而CQ不能；与CHX单药治疗相比，EPIC-1042和CHX的双重治疗进一步增强了PARP1的降解，然而，MG132和CQ都可以逆转这种作用。这些结果表明：在正常条件下，PARP1仅被UPS降解，而EPIC-1042通过自噬进一步诱导PARP1降解，这意味着EPIC-1042在PARP1蛋白的净余量中具有新的调节作用。

从图2B和图3E可以看出，在EPIC-1042处理早期(U87-MG 0-24 h, TBD-0220 0-16 h)， EPIC-1042不能显著提高LC3-Ⅱ水平，但可以显著提高p62水平。PARP1的加速降解也在相同的时间段发生。此外，免疫荧光显示，EPIC-1042分别处理TBD-0220和U87-MG细胞16和24 h后，自噬通量保持稳定状态（图中未展示）。这些结果提示p62可能介导PARP1的自噬降解，但不能排除UPS不参与PARP1加速降解的可能性。为了验证上述猜想，使用抗PARP1的抗体进行了免疫共沉淀实验。为防止PAPR1被大量降解，在EPIC-1042分别处理TBD-0220和U87-MG 8小时和16小时后，收集细胞沉淀。如图5F-G所示：PARP1的泛素化水平保持不变，但PARP1与p62的结合明显增加，这表明PARP1被迅速装载到自噬体中进行降解。为了进一步验证PARP1的稳定性下降是由于p62介导的选择性自噬，使用小干扰RNA在TBD-0220和U87-MG细胞中将p62敲低（KD），并分别用CHX或CHX+EPIC-1042处理16和24小时。结果发现，与对照组相比，p62敲低并不影响PARP1的蛋白水平，这也意味着先前存在的p62不介导PARP1的自噬降解。正如我们所料：在p62敲低组中，与CHX单药治疗相比，联合治疗未观察到额外的PARP1降解（图5H）。这些结果表明，EPIC-1042治疗后，p62结合的增加对于PARP1的选择性自噬降解至关重要，从而增强了TMZ的疗效。

图四，EPIC-1042在MGMT阳性的GBM中增敏替莫唑胺。

细胞毒性O ⁶ MeG容易被MGMT修复对TMZ产生耐药。PARP1能招募MGMT至DNA损伤位点和聚(ADP)核糖基化MGMT以促进O ⁶ MeG的修复。本课题组用EPIC-1042或TMZ处理MGMT阳性的T98G和LN-18 GBM细胞，以评估EPIC-1042对其TMZ敏感性的影响。本课题组发现EPIC-1042在处理24 h后对MGMT净剩余量没有影响（图中未展示），考虑到正常情况下MGMT降解是由UPS介导的，因此EPIC-1042无论通过增加p62或抑制自噬通量都不会影响MGMT稳定性。但是EPIC-1042是可以降低这些细胞系中的PARP1水平（图4A）。接着通过免疫荧光，用去除细胞内O ⁶ MeG的能力来评估MGMT的活性。如图4B所示：单独使用TMZ可以诱导O ⁶ MeG的微弱增加，然而，联合处理显著提高了O ⁶ MeG的积累。这些结果表明MGMT清除O ⁶ MeG的能力下降是受到PARP1降低的影响。如图4C-D所示，免疫印迹和免疫荧光证明细胞内γ-H2AX水平的变化趋势与O ⁶ MeG相同。此外，剂量-反应矩阵结果也显示TMZ与EPIC-1042具有协同作用，联合处理显著抑制了细胞系的增殖（图4E）。最后，在T98和LN-18细胞系中使用小干扰RNA敲低p62以阻断PARP1降解，免疫荧光显示：在p62敲低的细胞中，与TMZ处理组相比，TMZ+EPIC-1042共处理组中没有进一步积累O ⁶ MeG（图4F）。考虑到MGMT被UPS降解，而p62敲低对MGMT水平无影响，因此EPIC-1042诱导的p62结合至PARP1水平的升高促进了PARP1自噬降解，从而减少对MGMT的募集和多聚(ADP)核糖基化，进而增强TMZ的疗效。

图五，EPIC-1042在MGMT缺乏的GBM体内实验中，以剂量依赖性和长周期治疗方式增敏替莫唑胺。

利用TBD-0220细胞系建立原位GBM模型，进一步验证EPIC-1042以剂量依赖性方式增强TMZ疗效的能力（图5A）。生物发光成像和OS显示，与单独TMZ组相比，当与相同剂量的TMZ联合使用时，EPIC-1042对肿瘤生长抑制和裸鼠生存期延长具有显著的剂量依赖性（图5B-F）。Ki-67染色也支持这一趋势（图5G）。此外，免疫组化分析显示，与单独使用TMZ相比，当TMZ与最低剂量的EPIC-1042联合使用时，PARP1水平开始下降，且在剂量最高的EPIC-1042与TMZ联用治疗组中降低最为显著（图5G）。然而，γ-H2AX表现出与PARP1水平相反的趋势，这表明：随着EPIC-1042剂量的增加，与TMZ联用后对细胞的损伤进一步增强（图5G）。

接下来，在GBM裸鼠模型中将给药周期上调至6周（图5H）。脑MRI分析显示：TMZ+EPIC-1042联合治疗组的肿瘤负荷低于EPIC-1042或TMZ单独治疗组（图5I-J）。中位生存期的增加与肿瘤负荷成反比，联合治疗组表现出最长的OS获益（图5K）。综上所述，EPIC-1042能以剂量依赖性和长周期方式增强TMZ疗效。

图六，EPIC-1042前临床数据。

为了补充EPIC-1042的临床前数据，首先，对EPIC-1042对各种人细胞色素P450酶的抑制作用进行了评估，并以其特异性抑制剂作为阳性对照（图6A，展示不全）。EPIC-1042对 CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9和CYP2E1的IC ₅₀ 明显高于阳性对照组，表明EPIC-1042对这些同工酶的药物-药物相互作用影响较小。然而，对于CYP2B6、CYP2C19和CYP2D6，EPIC-1042的IC ₅₀ 值低于阳性对照组，表明EPIC-1042对这些同工酶有较强的抑制作用。有趣的是，对于CYP3A4，当其作用底物不同时，EPIC-1042展现出不同趋势的IC ₅₀ 。然后本课题组以氯氮平为阳性对照，利用小鼠、大鼠、狗、猴和人的肝微粒体测定EPIC-1042的体外代谢稳定性。如图6B所示：除了在人和猴肝微粒体孵育组中EPIC-1042与氯氮平半衰期(t _1/2 )非常接近外，其余各组EPIC-1042的半衰期(t _1/2 )均高于氯氮平，说明EPIC-1042在肝微粒体中相当稳定。此外，在HEK293中通过手动膜片钳法检测EPIC-1042的心脏毒性。如图6C所示：EPIC-1042的IC ₅₀ 大于10 μM，显著高于阳性对照药物西沙必利的IC ₅₀ (8.068 nM)（图中未展示）。结果表明EPIC-1042具有广泛的低心脏毒性。最后，在大鼠模型中建立EPIC-1042在静脉给药2 mg/kg和口服给药45 mg/kg后的平均血药浓度-时间分布图（图6D-E）。

结论：总之，本研究确定了一种多功能TMZ增敏剂EPIC-1042（图6F）。随着对EPIC-1042作用机制的阐明和体内外实验，EPIC-1042与经典化疗药物相结合将是一种有希望的新治疗策略，不仅可以应用于GBM，而且可以应用于其它类型的癌症。

天津医科大学总医院博士研究生洪彪、杨二艳和苏东元为该论文的第一作者，康春生教授为本文的通讯作者。该研究工作得到国家自然科学基金（NSFC，No. 82272893），天津市重点研发计划（No. 20YFZCSY00360）和广东省重点领域研发计划（No. 2023B1111020008）的支持。

文章链接：

https://doi.org/10.1093/neuonc/noad159

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