由于精确操纵DNA修复途径的困难，由双链断裂触发的大型转基因的高保真靶向整合本质上是低效的。
2023年7月4日，中科院动物所李伟及周琪共同通讯在
Cell Discovery
在线发表了题为“
High-efficiency targeted transgene integration via primed micro-homologues
”的研究论文，该研究
揭示通过始发态微同源物实现高效靶向转基因整合
。
始发态同源物辅助整合（PAINT）的改进版本，命名为PAINT 3.0，最大限度地提高了编辑效率，并最大限度地减少了偏离目标的集成，尤其是在处理无疤痕的帧内敲除（KI）时。使用PAINT 3.0，研究者将报告基因转基因靶向家政基因，其编辑效率高达80%，比传统的同源定向修复方法高出10倍以上。
使用PAINT 3.0插入2.5kb转基因在几个治疗相关的基因组基因座上实现了高达85%的KI频率，这表明其具有临床应用的潜力。最后，PAINT 3.0能够在原代T细胞中实现高效的非病毒基因组靶向，并产生具有特异性肿瘤杀伤能力的功能性CAR-T细胞。因此，研究者确定PAINT方法是一种用于大规模转基因整合的强大基因编辑工具，并可能为细胞和基因治疗以及基因组写入技术开辟新的途径。
总之，该研究利用先导编辑器设计了一种称为PAINT的稳健KI策略，该策略利用逆转录单链微同源物来增强不同类型细胞中的靶向KI
。
基于CRISPR/Cas9的基因编辑工具主要通过利用内源性DNA修复途径，如同源定向修复（HDR）、非同源末端连接（NHEJ）和一种称为微同源介导末端连接（MMEJ）的替代性NHEJ修复途径，实现大的外源DNA片段的靶向整合。
HDR是一种忠实的修复途径，通过利用同源姐妹染色单体或外源同源供体作为模板介导DSB修复。
CRISPR/Cas9在预选位点诱导的DSBs促进附近区域HDR介导的敲除（KI），质粒供体携带长同源臂（HAs，500–3000 bp），其位于外源DNA的侧翼。然而，质粒供体模板化HDR的活性本质上是低效的，这阻碍了基于HDR的方法在多种细胞类型中，特别是在人类细胞中介导大转基因的靶向KI的性能。
几项研究报告称，单链寡脱氧核糖核苷酸（ssODNs）可以用作供体模板，以实现高KI效率，但它们只能传递短编辑（<50个碱基）。
NHEJ是一种同源性无关、易出错的修复途径。
与HDR不同，NHEJ修复途径可以发生在整个细胞周期，是许多类型哺乳动物细胞中修复DSB的主要机制，包括神经元和肌肉细胞等非分裂体细胞。NHEJ途径也可以通过同时切割基因组DNA和NHEJ供体来驱动位点特异性转基因KI。
通过NHEJ途径，切除的双链转基因片段在DSB位点以随机方向重新连接基因组DNA，并可能在连接处留下indels。
利用NHEJ途径，同源性非依赖性靶向整合（HITI）已被证明通过在供体载体中重排CRISPR/Cas9靶向间隔区序列的方向来增强转基因在预期方向上的整合。
然而，连接位点上不可预测的indels阻碍了基于NHEJ的策略在介导框架内开放阅读框架融合中的应用。
除了HDR和NHEJ，MMEJ还被用于介导大的外源DNA的靶向整合。基于MMEJ的方法独立于长程HA在靶基因座实现了外源DNA的精确掺入。
然而，最近的报道表明，基于MMEJ的方法在哺乳动物细胞中通常效率低下。
先导编辑是一种新的基因编辑工具，用于处理小的缺失、突变和插入。逆转录酶（RT）与spCas9内切酶（H840A）偶联，形成PE–Cas9，该内切酶切割基因组靶位点，并在切割链的3′端延伸微同源瓣（MHF）和预期编辑。然后，通过独立于DSB的皮瓣交换和错配修复，将短编辑整合到目标部位。基于先导编辑的搜索和替换工作方式，以及用单链同源臂修饰的转基因可能促进靶向KI的假设，研究者推导了先导编辑（PE）在供体载体处理中的应用，并设计了一种基于PE的KI策略：PAINT。
始发态微同源悬突诱导高效的靶向转基因整合（图源自
Cell Discovery
）
PAINT方法，最初以PAINT 1.0为例，通过转基因盒每侧的逆转录单链微同源外伸（MHO）介导高效靶向KI。
先导编辑引导RNA（pegRNA）的优化进一步增强了其KI的功效。操纵控制细胞周期和DNA修复的机制表明，始发态微同源物介导的末端连接（PMEJ）途径以“复制和粘贴”的方式指示PAINT介导的靶向KI。这一发现启发研究者用MHF取代MHO，以避免基于NHEJ的线性化双链DNA（ldsDNA）的不精确整合。
PAINT的最终版本PAINT 3.0进一步结合了单MHF和双链HA，以处理无疤痕的帧内转基因整合，并实现了高保真KI，同时最大限度地减少了目标上和目标外的整合误差。
最后，PAINT 3.0被用于治疗相关基因组基因座中的靶向KI。PAINT 3.0介导的靶向原代T细胞中TRAC基因座的非病毒基因组产生了高达50%-60%的功能性嵌合抗原受体（CAR）-T细胞，当与肿瘤细胞共培养时，这些细胞表现出特异性杀伤活性。
研究者确定，PAINT策略是一种很有前途的基因编辑工具，为克服阻碍基因组工程技术发展的障碍提供了新的机会。
https://www.nature.com/articles/s41421-023-00552-0
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