杨景瑞，王莹，陈虎，吕永康：氧浓度对调节NOx氧化度协同CABR法脱硝性能及菌群结构的影响

氮氧化物（NO _x ），特别是一氧化氮（NO）和二氧化氮（NO ₂ ）是造成环境恶劣和人类健康问题的主要空气污染物。防止NO _x 污染的方法之一是减少火电厂烟气中NO _x 的排放，火电厂排放的烟气是大气中NO _x 的主要来源。由于烟气中NO _x 的主要成分NO在水溶液中的溶解度很低，传统的吸收方法难以去除。大量研究结果表明，通过使用某些氧化性物质将部分NO氧化为NO ₂ 后可大大提高NO _x 在碱液中的吸收效率，且NO _x 氧化度在50%~60%时吸收效率最高。因此，基于氧化吸收理念，调节NO _x 氧化度协同化学吸收-生物还原法是一种可靠、经济可行的烟气脱硝技术。该方法首先调节烟气中NO _x 氧化度为50%，之后气相中的NO _x 经碱液吸收后在液相中生成含氮化合物，最后通过好氧反硝化菌作用将液相中的含氮化合物还原为无毒无害的N ₂ 排出。

由于我国实际工业烟气中通常含有3%~8%的氧气，以往研究结果显示，氧体积分数是影响NO _x 去除的关键因素之一。目前，关于利用化学吸收-生物还原（CABR）法脱硝的研究大多是采用络合剂Fe(Ⅱ)EDTA络合NO先形成Fe(Ⅱ)EDTA-NO络合物，然后再通过微生物作用将NO还原为N ₂ 。虽然这一方法提高了吸收剂的吸附能力和再生能力，但由于Fe(Ⅱ)易被烟气中本身含有的氧气氧化生成Fe(Ⅲ)，从而失去络合NO的能力。因此，该方法还远远不能用于工业规模。

本文采用调节 NO _x 氧化度协同化学吸收-生物还原法去除烟气中NO _x ，这一脱硝途径将氧化吸收与生物还原相结合，不使用络合吸收剂。因此，研究氧体积分数对这一脱硝过程脱硝性能的影响至关重要。为此，本文考察了烟气中包含氧体积分数在0~10%范围内对调节NO _x 氧化度协同化学吸收-生物还原法去除NO _x 的影响。此外，研究指出氧气对NO _x 还原和反硝化微生物生长均有负面影响。微生物群落结构会随操作条件的改变而发生变化，菌群结构决定了生物反应器的性能。因此，在CABR系统的氧气关键工况下，分析生物反应器内微生物群落结构是十分必要的。本文利用高通量测序技术分析了不同氧体积分数下生物反应器内微生物群落结构的变化，同时考察了不同氧体积分数对生物反应器内微生物胞外聚合物的影响。这项研究工作将清楚地说明微生物群落对氧体积分数变化的响应及其对NO _x 去除性能的影响。本研究也为通过接种富集培养物强化生物反应器提供了有价值的见解。

气体：NO（4.999%，其余为N ₂ ）、NO ₂ （4.999%，其余为N ₂ ）、N ₂ （99.999%）、O ₂ （99.999%）和CO ₂ （99.999%）。实验室所用气体均由太原安旭鸿运科技有限公司提供。

富集培养基（LB）成分：NaCl，10g；酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；pH=7.0。

反硝化培养基（DM）成分：柠檬酸钠，4.20g；NaNO ₃ ，0.607g；NaH ₂ PO ₄ ·2H ₂ O，0.250g；K ₂ HPO ₄ ·3H ₂ O，0.750g；FeSO ₄ ·7H ₂ O，0.050g；NaCl，0.120g；MgSO ₄ ·7H ₂ O，0.050g；MnSO ₄ ·H ₂ O，0.010g；pH=7.0。

循环吸收营养液成分：柠檬酸钠，4.20g/L；K ₂ HPO ₄ ·3H ₂ O，0.750g/L；NaH ₂ PO ₄ ·2H ₂ O，0.250g/L；FeSO ₄ ·7H ₂ O，0.050g/L；MnSO ₄ ·H ₂ O，0.010g/L；NaCl，0.120g/L；MgSO ₄ ·7H ₂ O，0.050g/L；NaHCO ₃ ，1.68g/L。所有化学品均为分析纯级试剂，无须进一步纯化即可直接使用。

在烟气中包含氧体积分数为0这一个运行阶段末期，从生物滴滤塔内上中下三个部位分别收集一个生物膜载体合为一个样本，并将其命名为S1。之后分别在烟气中包含氧气体积分数为3%、5%、8%和10%的运行阶段末期，按同样的方法各收集一个样本，分别命名为S2、S3、S4和S5。并委托上海生工公司运用高通量测序技术对五个样本进行了分析和鉴定。

根据制造商的说明，使用EZNA® Soil DNA Kit（OMEGA，USA）分别提取各个样本总群落基因组DNA。使用Qubit 2.0（life，USA）来测量DNA体积分数，以确保提取了足够数量的高质量基因组DNA。利用PCR扩增菌群16S rRNA V3-V4高变区，正反引物分别为341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATTCTAATCC）。总扩增反应混合物为30μL，其中包含15μL的2×Taq master Mix，2μL的基因组DNA（10ng/μL），10μmol/L的正反向引物各1μL和高纯水。PCR扩增的反应条件如下：95℃变性3min；接下来95℃ 30s、45℃ 30s、72℃ 30s进行5个循环；然后95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s进行20个循环；最后72℃延伸5min。每个反应混合物的扩增子根据其体积分数以相同的摩尔比合并。然后通过Illumina MiSeq平台（USA，Illumina MiSeq）按照制造商的说明进行测序。

测序后，数据收集如下：①利用PEAR(v0.9.6)软件根据重叠部分对两个短的Illumina读数进行拼接，对fastq文件进行处理，生成单独的fasta和qual文件；②然后将含有不明确碱基且长度超过480bp或短于200bp的序列去除；③将所有相同的序列合并为一个；④根据定制的参考数据库对序列进行比对；⑤检查索引和接头的完整性，并删除所有索引和接头序列；⑥使用Pre.cluster工具去除干扰信号。将每个样本的有效序列提交给RDP分类器，以识别古细菌和细菌序列。使用mothur计算覆盖率、Chao1、ACE、Simpson和Shannon在内的物种丰富度和多样性统计数据。

按照Niu等描述的方法提取松散结合型胞外聚合物（LB-EPS）和紧密结合型胞外聚合物（TB-EPS）。LB-EPS和TB-EPS含量通过蛋白质和多糖的加和量来表示。采用福林-酚法和苯酚-硫酸法利用总有机碳（TOC）分析仪在700nm和490nm处分别测定蛋白质和多糖含量。

NO与NO ₂ 体积分数采用便携式烟气分析仪（KANE, KM-9106）进行检测。NO _x 去除效率用如式(1)计算。

考虑到烟气中NO _x 被循环液吸收后可能在液相中生成不同体积分数的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮。因此，在生物滴滤塔挂膜成功后，紧接着研究了营养液中包含不同体积分数的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮对生物滴滤塔内微生物反硝化性能的影响（阶段Ⅲ~Ⅵ）。由图2可知，当营养液中存在不同比例的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮体积分数时，生物滴滤塔出水中氮氧化物体积分数不变。这说明吸收营养液中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮不管以何种比例存在时，都不会对生物滴滤塔内微生物的好氧反硝化性能造成影响。

因此，从第Ⅶ阶段开始不再向营养液中额外添加氮源，开始添加体积分数为0.1mol/L的NaHCO ₃ 作化学吸收剂形成NO _x 吸收液。同时开始向生物滴滤塔内通入模拟烟气，其中包含NO和NO ₂ 体积分数各250μL/L。图中显示，在生物滴滤塔内初次通入NO _x 气体时，出口气体中含有约50μL/L的NO气体，但几乎不存在NO ₂ 气体。然而随着运行时间的增加，尾气中NO的体积分数在逐渐降低，运行4天后检测到出口尾气中NO含量维持在5μL/L左右，从而使NO _x 的去除效率达到99%左右。这说明生物滴滤塔内的微生物群落逐渐适应了通入模拟烟气的环境，可以维持稳定运行的状态。综上所述，生物滴滤塔在启动阶段后运行良好，可进一步研究。

氧气的存在对液相中 -N和 -N的形成至关重要， -N和 -N在不同氧气体积分数下的体积分数变化如图3(d)所示。随着氧气体积分数的增加，液相中 -N体积分数呈现轻微上升趋势， -N体积分数则保持稳定，不存在 -N的积累。在整个运行过程中，液相中 -N含量显著高于 -N，但 -N积累量未超过2mg/L。而Li等的研究报道指出，采用络合吸收剂的CABR系统进行烟气脱硝时，液相中 -N积累量从氧气体积分数为0的15mg/L左右增加到了氧气体积分数为10%的45mg/L。这一结果表明，络合吸收耦合生物还原烟气脱硝系统在很大程度上是将部分烟气中的NO _x 从气相转移到了液相中，液相中积累的含氮氧化物并没有被完全去除。这可能是因为络合吸收剂对微生物的生长和还原有一定的抑制作用。而本研究首先通过调节烟气中NO _x 氧化度为50%，然后再利用弱碱液吸收与生物还原相结合的方法来进行烟气脱硝。该过程不使用络合吸收剂，烟气中NO _x 进入生物滴滤塔后经碱液作用，将气相中的NO _x 转化为液相中的 -N和 -N，然后通过微生物的反硝化作用几乎可将液相中的含氮氧化物全部去除，可以实现烟气中NO _x 最终被去除的目的。实验结果还表明，随着氧气体积分数从0增加到10%，液相中COD的含量在逐渐降低，由原来的910mg/L降低至11mg/L。

综上所述，本研究烟气脱硝系统在高含氧量条件下仍具备高效脱硝的能力，这一结果进一步体现了本研究脱硝技术的优势。

微生物聚集体的胞外聚合物（EPS）是一种复杂的高分子量聚合物，由微生物分泌和细胞裂解产生，并从废水中吸附有机物。EPS对微生物聚集体的理化性质有显著影响，包括结构、表面电荷、絮凝、沉降、脱水和吸附能力。EPS通过复杂的相互作用与细胞结合，形成巨大的网状结构，含有大量的水，它们为细胞形成一层保护层，可以抵御有毒物质或者外部恶劣环境对细胞的危害，在营养缺乏的条件下，部分EPS可作为碳源或能源。多糖（PS）和蛋白质（PN）通常是EPS的主要成分。根据空间位置的不同，EPS可分为松散结合型EPS（LB-EPS）和紧密结合型EPS（TB-EPS）。对EPS的深入研究不仅可提高对液相中生物脱氮的认识，而且对通过优化操作参数来提高本研究系统烟气脱硝的效率具有重要意义。

基于上述研究背景，对本研究脱硝系统在不同氧气体积分数（0、3%、5%、8%和10%）下运行阶段末期微生物产生的LB-EPS和TB-EPS含量进行了检测，结果如图4所示。结果表明，微生物EPS含量与烟气中包含的氧气体积分数密切相关，LB-EPS和TB-EPS含量随着氧气体积分数的增加都呈现先升高后降低的趋势，且都在氧气体积分数为5%时达到最大值。不同氧气体积分数下，微生物群落产生的LB-EPS含量普遍高于TB-EPS含量。LB-EPS具有黏附作用，可以增强细胞聚集过程。TB-EPS具有一定的絮凝作用。微生物产生的EPS组分中LB-EPS占主要部分，这说明在外界不断升高的氧环境下，微生物细胞可能是通过聚集来抵御外界的恶劣环境，使细胞保持活性，进而使系统在高氧环境下继续维持高效的脱硝效率。此外，LB-EPS含量的增加使细菌的黏附作用增强，这可能在一定程度上也增强了微生物对气相中NOx的吸附作用。图4(a)显示，在氧气体积分数由0逐渐增加至5%的过程中，LB-EPS中PN/PS的比值由1.72上升到2.18，表明氧气体积分数的增加更容易引起LB-EPS中PN含量的变化，导致PN的含量显著增加。造成这一现象的原因可能是因为面对氧气体积分数升高的恶劣环境，微生物在未适应之前，通过分泌更多的PN来提高细胞的抵抗能力，保护细胞免受恶劣环境的侵害。随着氧气体积分数从0增加至5%，而TB-EPS中PN/PS的比值从1.21降至0.706，这表明氧气体积分数的增加更容易引起TB-EPS中PS含量的增加[图4(b)]。PS分子中含有较多的极性基团，其与水分子结合能力较强，PS含量的增加可以降低细胞内水分的流失，这在一定程度上保护了细胞的活性。在氧气体积分数达到8%和10%的条件下，LB-EPS和TB-EPS含量减少的原因一方面可能是因为微生物逐渐适应了高氧环境导致自身分泌物减少，另一方面可能是因为细胞的解体减少，因为细胞解体也会释放部分PN和PS。

2.4.1  微生物群落的多样性和丰富性

通过高通量测序对不同氧气体积分数下收集的微生物样本S1、S2、S3、S4和S5的群落结构进行评价。Alpha多样性通常使用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数计算。当前三项指标较大或后一项指标较小时，则认为样本中的物种相对丰富。其中Chao1和ACE指数用来估计微生物群落中包含的OTU数目，Chao1和ACE指数值越大，表明微生物群落的丰富度越高。Shannon和Simpson指数用来估算样品中微生物的多样性，Shannon指数值越大或者Simpson指数值越小，代表物种的多样性越高。

表2中Coverage指数表明，5个样本的细菌基因库覆盖率均为100%，说明各个样本中大部分微生物都已被检测到，测序结果具有较高的可信度。随着氧气体积分数的升高，样本表面微生物的Chao1和ACE指数逐渐升高（即S5>S4>S3>S2>S1）。这说明随着氧气体积分数的升高，物种的丰富度也逐渐升高。根据表2中Shannon和Simpson指数值变化趋势可知，在氧气体积分数逐渐增加到8%的过程中，微生物多样性呈现先减小后增大的趋势，表明适应高氧环境的微生物种类逐渐增多。此外，韦恩图分析表明S1~S5样本中产生的OTU数量为227~630，在氧气体积分数为10%的样本中包含的OTU数最多。而且S1~S5样本间有57个OTU数是共享的，说明不同氧气体积分数样本的微生物群落结构具有显著的相似性。

2.4.2  微生物群落的组成和变化

图5显示了不同氧气体积分数样本中微生物群落结构在门、类和属水平的相对丰度分布情况。在门水平上[图5(a)]， Proteobacteria 是所有样本中最丰富的门（55.0%~85.7%），其次是 Firmicutes （1.57%~33.0%）和 Bacteroidetes （2.14%~11.0%）。这些优势菌门被发现有助于去除污染物，特别是在废水处理中。但这些优势菌门的丰度随氧气体积分数的升高变化明显，优势 Proteobacteria 菌门丰度随氧气体积分数的升高呈现先增后减的趋势，这种变化趋势与Sun等的研究结果相一致。而随着烟气中氧气体积分数的升高， Firmicutes 丰度则逐渐减小，这可能与 Firmicutes 菌是典型的厌氧反硝化细菌相关， Firmicutes 菌普遍存在于厌氧反硝化系统中。当氧气体积分数升高至10%时，S5样本中优势菌门 Bacteroidetes 的丰度显著增加。换句话说，在本研究脱硝系统中，升高烟气中氧气体积分数会导致系统内优势菌门发生变化。

在类水平上[图5(b)]， Bacilli 是S1样本中最占优势的菌类，其相对丰度达到31.4%。而在S2~S5样本中，该菌类的相对丰度逐渐降低，最终降为S5样本中的1.38%。Verbaendert等的研究结果已指出Bacilli是具有反硝化能力的菌株。其次， Betaproteobacteria 为S1样本中的第二优势菌类，其相对丰度为12.1%。该菌类的相对丰度在样本中的变化趋势与 Bacilli 相同，都是随着氧气体积分数的升高其相对丰度呈下降趋势。而 Alphaproteobacteria 的丰度则随着氧气体积分数的升高呈现先升后降的趋势，在氧气体积分数为8%的样本（S4）中其相对丰度达到最大值42.0%，在氧气体积分数10%时，其相对丰度又降为17.4%。此外， Gammaproteobacteria 也是S1~S5五个样本中的主要优势菌类之一，其相对丰度为8.73%~19.7%。有研究报道称， Alphaproteoba cteria 和 Gammaproteobacteria 都属于sub- Proteobacteria 菌，都具备高效的脱氮能力。五个样本在类水平上的优势物种基本一致，但它们的相对丰度受氧气体积分数影响会发生相应变化。这种变化趋势与之前的一项研究结果相似，因为氧气体积分数的变化会影响微生物的群落结构。Zhang等研究结果表明，随着生物滤池内溶解氧气体积分数的升高，对生物滤池内微生物的种类并未造成显著影响，但对细菌的相对丰度有明显的影响。

在属水平上[图5(c)]，S1~S5五个样本中共检测到48个菌属。 Chelatococcus 是五个样本间共有的优势菌属，其相对丰度为4.36%~17.6%。 Chelatococcus 菌属在高温50°C环境中仍可保持活性且具有高效的好氧反硝化能力已被广泛报道，并已将其应用于烟气脱硝研究。S1与S2样本中优势菌属种类没有太大差别，主要包括 Azoarcus 、 Taibaiella 和 Chelatococcus 。与S1相比，S2和S3样本中 Oxalophagus 菌属的相对丰度显著增加，由S1中的0.2%增加为S2和S3中的3.49%和16.3%，成为S3样本中最丰富的菌属。然而，在S4和S5样本中， Oxalophagus 菌属已基本灭绝。S4样本中 Pannonibacter 菌属出现明显积累，是该样本中的第二优势菌属，相对丰度达到12.6%。 Craurococcus 是第三丰富的菌属，相对丰度为10.2%。 Chelatococcus 、 Oxalophagus 和 Craurococcus 菌属的总丰度高达40.4%，除未归类的菌属外，它们是S4样本中的绝对优势菌属。与S4相比，S5样本中这三种菌属的丰度明显降低。S5样本中的第二优势菌属变为 Taibaiella ，相对丰度为7.52%。在属水平上微生物群落结构的差异进一步表明了氧气体积分数的影响。此外，不同氧气体积分数下微生物在属水平的物种丰富度矩阵图进一步表明S1~S5五个样本中的优势菌属主要包括为 Chelatococcus 、 Taibaiella 、 Craurococcus 和 Azomonas （图6）。这与在属水平上检测到的五个样本中包含的优势菌属种类相同。

（1）本文研究了烟气中不同氧气体积分数对调节NO _x 氧化度协同CABR法脱硝效率及微生物群落结构的影响。结果表明，烟气中氧气体积分数为0~8%时，CABR系统对NO _x 的去除效率保持恒定，达到99%以上。且在氧气体积分数增加的整个过程中，液相中不存在氮氧化物的积累。

（2）生物滴滤塔内微生物EPS含量随氧气体积分数的增加呈现先增后减的趋势，在氧气体积分数为5%时EPS含量最高。这是由于EPS含量与微生物对外界恶劣环境的抵抗力密切相关。

（3）高通量测序结果表明，在不同氧气体积分数下 Proteobacteria 是系统内的优势菌门， Chelatococcus 是主要的优势菌属，系统内优势菌均为好氧反硝化菌。菌群丰度决定了系统的脱硝效率。