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Nat. Chem.: 利用分子内环闭合方法将聚甲炔化合物转化为荧光染料的通用策略

时间：2023-12-08 来源： 浏览：

Nat. Chem.: 利用分子内环闭合方法将聚甲炔化合物转化为荧光染料的通用策略

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荧光成像是研究生物过程的宝贵工具，其进一步进展取决于先进荧光探针的发展，这种探针能够到达细胞内靶点并对其进行高特异性标记。优异的荧光罗丹明染料已有报道，但它们的合成通常需要长时间且产量低，并且光谱限制在可见范围内。
近日， 瑞士苏黎世大学 Pablo Rivera-Fuentes教授课题组 提出了一种利用分子内环闭合方法将聚甲炔化合物（polymethine compounds）转化为荧光染料的通用策略。 研究成果以“A general strategy to develop fluorogenic polymethine dyes for bioimaging”为题发表在  Nature Chemistry 上。 第一作者为 Annabell Martin 博士， 通讯作者为 Pablo Rivera-Fuentes 教授。
本文通过制造在可见光和近红外光谱范围内发射的自发闪烁和无需洗涤的聚甲炔染料，说明了该方法的普适性。这些探针与自标记蛋白和小分子靶向配体兼容，并可与罗丹明基染料结合，用于多色和荧光寿命复用成像。与现有的罗丹明染料相比，这种探针的发射波长红移更多，因此可以获得明亮的荧光染料。
图1羰. 花青和HMSiR的分子内环化反应(1)
有效的荧光染料在与其预期目标结合前 必须以非荧光形式存在 。在基于环化的荧光性的情况下，这意味着开环的势垒必须高， 闭环的势垒必须低 。极性环化反应的有利性可以使用称为鲍德温规则来估计。传统聚甲炔 荧光 染料制造中，分子内环化是5-endo-trig类型，根据鲍德温规则，这是不利的。这种环化（图1a）被归类为5-endo-trig，因为它涉及五元环的形成，其中包含（endo）由亲核试剂攻击的三角（trig）碳的双键形成的单键（图1a）。尽管 6-endo-trig 环化应该比 5-endo-trig 更有利，但过去使用 6-endo-trig 环化来赋予荧光性的尝试并没有产生更稳定的环状异构体。基于这些观察，本研究假设 5-exo-trig 环化——其中双键攻击时形成的单键不包含（exo）在新形成的环内（图 1b）——将是一种更有效的环化反应的有效的替代方案。
为了验证本研究的假设，使用密度泛函理论 (DFT) 计算了 HMSiR (1) 的开环和闭环能量--HMSiR 是一种硅罗丹明衍生物，能够发生高效的 5-exo-trig 分子内环化反应（图 1c）。然后，将这些值与 Cy5 衍生物 2、3 和 4a 的计算值进行了比较（图 1d-f），这些衍生物分别进行了 5-endo-trig、6-endo-trig和 5-exo-trig环化反应。与 Cy5 衍生物 2 和 3 相比，HMSiR (1) 的开环能较大，而闭环能较小，这两种衍生物分别经历了 5-endo-trig 环化和 6-endo-trig 环化（图 1c、d）。相比之下，Cy5 衍生物 4a 的开环能和闭环能与 HMSiR (1) 的计算值相当（图 1c，f）。
研究还观察到，在 Cy5 染料中加入吸电子基团可进一步提高封闭异构体的稳定性（例如衍生物 4b），从而进一步调节开环和闭环的能量。这些预测表明，只需采用 5-exo-trig 环化，而不是 5-endo-trig 环化，就能获得更稳定的聚甲炔荧光染料。
图2. 5-endo-trig 和 5-exo-trig Cy5 衍生物的合成与成像特性
为了验证这些计算预测，本研究根据已发表的策略制备了吲哚鎓构筑模块 5、6、7a-d 和连接体 8（图 2a）。接下来，本研究通过两步微波辅助程序合成了 5-endo-trig Cy5 探针 2a 和 2b。5-exo-trig Cy5 探针 4a 和 4b 分两步通过甲酯中间体 9a-d 制备，然后用 LiAlH 4  还原（图 2a）。本研究对这些 Cy5 衍生物进行了 pH 滴定，以评估封闭异构体的稳定性（图 2b ）。5-endo-trig 探针的 pH 滴定显示开环 pK a  值高于生理 pH 值（2a 为 11.1，2b 为 8.5），表明这些探针在细胞中作为游离小分子将具有高荧光性。相比之下，5-外-三聚体探针的开环 pK a  值低于 7（4a 为 6.4，4b 为 5.7），表明它们可能只在酸性区室中显示一些荧光。此外，5-外向-三位化合物 4a 和 4b 在低介电常数介质中的环化倾向比 5-内向-三位化合物 2a 和 2b 高得多。
在活细胞成像实验中（图 2c），5-内向三聚体探针 2a 和 2b 在线粒体中显示出明亮的荧光（图 2c）。这种亚细胞定位可能是开放式 Cy5 支架正电荷分散的结果。相比之下，5-exo-trig 探针 4a 和 4b 只显示出非常微弱的荧光，主要定位于溶酶体（图 2c）。这些结果证实，经过 5-exo-trig 环化的闭合探针（4a 和 4b）在生理条件下非常稳定，在活细胞成像中可大大减少非特异性背景。
图3. 荧光Cy5 衍生物的合成、体外评估和活细胞验证
接下来，采用 5-exo-trig 成环策略，开发出了一种免清洗荧光 Cy5 衍生物。在合成了几种衍生物并测试了 pH 值和极性对其环化平衡的影响之后，本研究将 9c 的甲酯基转化为 N-甲基酰胺 12，并制备了相应的 5-内向-三叉吲哚鎓 13 和 Cy5 探针 14（图 3a）。这些含炔衍生物与苄基鸟嘌呤 10 共轭，生成探针 15 和 16（图 3b）。将这些染料与纯化的 SNAP 标记蛋白混合后，化合物 15 的吸光度增加了 6 倍，荧光增加了 19 倍。更大的荧光亮度表明，与溶液中的游离染料相比，与 SNAP-tag 结合不仅会诱导开环，还会提高化合物 15 的发射量子产率。相比之下，化合物 16 与 SNAP-tag 结合后，吸光度和荧光分别只增加了 1.4 倍和 2.5 倍（图 3c）。
探针 15 的体外荧光性与用于 SNAP 标记的常用苄基鸟嘌呤功能化 JF646 染料（JF646-BG）的体外荧光性相当（图 3c）。这一观察结果证实，与罗丹明的开启机制类似，聚甲炔染料的 5-exo-trig 环化在与蛋白质靶标结合后可以逆转。
研究还进行了免洗活细胞成像，以比较探针 15、16 和 JF646 的性能。用编码融合蛋白 H2B-SNAPf-mTurquoise2 的质粒转染 HeLa 细胞，并用染料 15、16 或 JF646-BG 对其进行孵育（图 3d）。探针 15 在细胞核中显示出明亮的荧光信号，只有非常微弱的非特异性背景信号。这一性能与 JF646-BG 相当（图 3d）。另一方面，探针 16 显示的荧光信号弱于 JF646-BG（图 3d）10 倍以上，这表明它的膜渗透性可能较弱。
图4. 荧光Cy3 和 Cy7 衍生物的合成、体外评估和活细胞验证
制备了用于 SNAP 标记的 Cy3 衍生物 19 和 Cy7 衍生物 20（图 4a）。这两种探针与纯化的 SNAP-tag 蛋白结合后都显示出荧光特性，19 的吸光度增加了 6 倍，20 的吸光度增加了 11 倍，19 的荧光增加了 28 倍，20 的荧光增加了 124 倍（图 4b）。与化合物 15 相似，荧光的大幅开启表明，与溶液中的游离染料相比，与 SNAP 标记的结合大大提高了这些探针的发射量子产率。探针 19 和 20 随后被用于对瞬时转染了前述 H2B-SNAPf-mTurquoise2 质粒的 HeLa 细胞进行免洗活细胞成像实验。本研究观察到 mTurquoise2 参考信号与 19 和 20 的黄色和近红外荧光信号有很好的共定位，证实了探针的特异性（图 4b）。对其他细胞结构进行标记也得到了类似的结果。探针 15、19 和 20 覆盖了可见光谱的大部分，并延伸至近红外区域。探针 15 和 20 与 SNAP-tag 结合后显示出极好的亮度和光稳定性（图 4c、d）。Cy3 衍生物 19 的亮度和光稳定性较差，但可以通过引入取代基或使聚甲基链更硬来进一步调整这些特性。
将探针应用于多重实验。首先，使用 Cy5 荧光染料 15 和广泛使用的 JF549-Halo 染料进行了多色成像实验。通过在共转染了 H2B-SNAPf-mTurquoise2 和 TUBB5-HaloTag 的活 HeLa 细胞中成像 15/JF549-Halo 对，证实了本研究的荧光探针与罗丹明-HaloTag 共轭物的正交性（图 4e）。
接下来探讨了 Cy3 衍生物 19 和 JF549-Halo 的荧光信号是否可以通过它们的激发态寿命来区分，这两种衍生物的激发和发射波长几乎完全相同。本研究用 H2B-SNAPf-mTurquoise2 和 TUBB5-HaloTag 共同转染 HeLa 细胞，并进行了荧光寿命成像（FLIM）。虽然不能通过波长来区分信号（图 4f），但通过相位图分析，可以很容易地通过它们的平均激发态寿命（19 为 2 ns，JF549-Halo 为 4 ns，图 4g）来区分它们。
本研究提出一种通过 5-exo-trig 闭环方法来赋予聚甲炔染料荧光性的通用策略。这些染料无论其激发波长如何，都可以通过两个高产步骤轻松合成，并且很容易通过改变吲哚鎓结构单元或闭环分子进行衍生。本研究通过生成自发闪烁的 Cy5 染料、荧光 Cy3 和 Cy5 染料以及明亮、光稳定的近红外荧光剂 Cy7，展示了本研究在制备聚甲炔荧光染料方面的潜力。与相同光谱范围的荧光蛋白（例如 miRFP718nano，ε j  = 4,500 M -1  cm -1  和 λ em  = 718 nm）相比，Cy7 衍生物探针 20 具有高亮度（ε φ ：消光系数与量子产率的乘积）和长发射波长（ε j  = 27,300 M -1  cm -1  和 λ em  = 784 nm）。此外，本研究还发现这些探针可用于免清洗共聚焦活细胞显微镜和 SMLM；还可与广泛使用的罗丹明-HaloTag 结合物结合，用于多色和多重寿命成像实验。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41557-023-01367-y

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