温州大学彭仁义团队JEMA：硝普钠缓解纳米塑料暴露导致的斑马鱼幼鱼的发育毒性

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成果简介

近日，温州大学生命与环境科学学院彭仁义团队在环境领域著名学术期刊 Journal of Environmental Management 上发表了题为 “Sodium nitroprusside alleviates nanoplastics-induced developmental toxicity by suppressing apoptosis, ferroptosis and inflammation” 的研究性论文 。 本研究首次发现硝普钠可以显著抑制纳米塑料暴露导致的发育毒性症状，有效缓解了纳米塑料暴露导致的斑马鱼幼鱼线粒体依赖的细胞凋亡、脂质过氧化诱发的铁死亡及免疫炎症反应 。

纳米塑料（ nanoplastics ， NPs ）是指粒径小于 100 nm 的微塑料，具有粒径小、比表面积大、细胞和组织屏障穿透能力强和生物吸收率高的特点，其在环境和消费品中无处不在，导致生物体难以避免地暴露在 NPs 污染环境条件下，例如，野生动物、植物、海藻、鱼类等通过摄食、呼吸、静电吸附等方式摄取 NPs ，并进一步通过食物链转移到上层营养级的其它生物体内，最终可能在人体内汇集。因此， NPs 所造成的环境污染和对包括人体在内的生物机体健康损害，已经成为亟待解决的全球性科学问题之一。近年来，斑马鱼被广泛应用于 NPs 生物毒理学评价及作用机制的研究，并取得了诸多进展，这些研究成果为揭示 NPs 的机体毒理作用机制提供可靠的证据支持。 NO 是一种重要的生物信使分子和效应分子，其在细胞及分子水平上的基础调控功能为其在医学上的应用奠定了基础。我们在探索 NPs 生物毒性效应时发现：相比正常生长发育条件的斑马鱼幼鱼， NPs 暴露导致了显著的成活率下降，畸形率及器官水肿上升等发育毒性效应；补充适量的硝普钠（ Sodium nitroprusside ， SNP ）显著缓解了 NPs 导致的发育毒性症状。该现象说明 NO 发挥了积极的调控作用，但外源 NO 是通过何种方式或途径在活体细胞内发挥调控功能仍不清晰，需要进一步 深入探索。

NO-sGC-cGMP 信号通路是内源信号分子 NO 执行功能的基础通路，作为 NO 受体的可溶性鸟苷酸环化酶（ sGC ）与 NO 结合后被激活，催化 GTP 转化为 cGMP ，激活多种效应分子，引发下游一系列级联应答反应。细胞内适量的 NO 对维持细胞稳态不可或缺，因此，我们首先检测了 NPs 暴露条件下细胞内源 NO 含量，发现 NPs 暴露的斑马鱼幼鱼细胞内 NO 显著升高，但 NO-sGC-cGMP 信号通路相关的关键酶活性和关键物质含量显著降低。由此推测： NPs 暴露有可能造成 NO-sGC-cGMP 信号通路被抑制或者阻断，引起内源性 NO 的生物利用受阻，进而导致暴露后期出现比较严重的发育毒性效应。用 NO 处理 NPs 暴露的斑马鱼幼鱼后，发育毒性缓解的同时，信号通路相关的关键酶活性和关键物质含量显著上升。此外，适量的外源 NO 处理并未显著提升细胞内 NO 和强氧化物质 ONOO- 含量的增加，避免了额外的细胞毒性。转录表达检测发现 Adma 与 Nos 都与 NO 的生物合成密切相关，前者会增加 ROS 的生成，并导致内皮源性 NO 的氧化失活，而 Pde6d 和 Prkg 都与 sGC 与 cGMP 的代谢紧密相关，这些关键基因的表达变化也进一步证实了 NPs 暴露抑制了 NO-sGC-cGMP 通路的信号转导，而硝普钠的处理激活了该信号通路 。

氧化应激、细胞凋亡的机制研究

过量的细胞凋亡可造成不同程度的发育毒性。在本研究中，我们检测到了 NPs 暴露导致的过量细胞凋亡，但细胞凋亡的发生有多条路径，而线粒体依赖的细胞凋亡就是其中重要且经典的路径之一，另外，线粒体也是 ROS 产生的主要场所之一，过量的 ROS 积累又会反向损害线粒体的结构与功能，进一步诱发细胞凋亡。因此，我们一方面检测了 NPs 暴露条件下斑马鱼幼鱼细胞内线粒体的数量及膜电位，发现线粒体数量显著降低，线粒体膜电位发生去极化。另一方面检测了线粒体调控细胞凋亡途径关键酶 Caspase-3 的酶活性，发现显著升高。为了验证上述结果，我们对线粒体依赖的细胞凋亡途径关键基因 Bik 、 Bad 、 Bax 、 Bim 、 Bid 和 Bok 进行转录表达检测，发现均显著上调表达。当对斑马鱼幼鱼进行 NO 处理后，细胞凋亡得到抑制，线粒体数量及膜电位显著恢复， Caspase-3 的酶活性及关键基因表达量受到显著抑制。因此， NPs 暴露启动了斑马鱼幼鱼细胞内线粒体依赖的细胞凋亡，硝普钠处理激活了 NO-sGC-cGMP 信号通路，进而抑制了这一过程的发生 。

NPs 暴露诱发的铁死亡得到显著缓解

在本研究中， NPs 诱导的斑马鱼幼鱼 ROS 的过量积累为铁死亡的发生提供了充分条件，但是否真实发生仍需验证。我们使用 Fer-1 处理 NPs 暴露的斑马鱼幼鱼，发现并不影响幼鱼的孵化率，但可以显著提升幼鱼成活率和降低其畸形率，同时，死亡率与畸形率依然显著低于 control 组。因此，铁死亡是 NPs 暴露导致的重要下游生理效应，但并不唯一。我们进一步检测了细胞内铁死亡关键物质铁离子、 LPO 含量变化及关键蛋白 GPX4 表达量变化，结果显示 NPs 暴露导致细胞内铁代谢紊乱，脂质过氧化物显著增加，而抑制铁死亡的核心关键蛋白 GPX4 表达量则显著降低。转录表达检测发现，调节脂质形成的关键酶基因 Acsl4a ，调控生成抗氧化蛋白和降解铁蛋白的关键基因 Keap1b 和 Ncoa4 在 NPs 暴露条件下都显著上调表达。相反，作为铁死亡抑制剂的胱氨酸 / 谷氨酸逆转运蛋白 system xc- 的关键合成基因则显著下调表达。这些铁死亡标志性的指标在硝普钠处理后都得到显著的反转变化，因此证实铁死亡过程得到显著缓解。

硝普钠缓解 NPs 暴露导致的炎症反应

NPs 暴露条件下， NPs 和 ROS 主要积累在斑马鱼幼鱼的内脏部位，这也导致了该部位比较严重的细胞凋亡，这些生理过程的发生都伴随着免疫炎症反应的发生，并且二者相互促进，螺旋交替增强。我们检测了巨噬细胞和中性粒细胞的数量，发现 NPs 暴露导致这两种免疫细胞大幅增殖。进一步检测炎症因子转录表达量，发现 Tnfa 、 Tgfb 、 IL-4 和 IL-6 这几种炎症因子基因显著上调表达。 SNP 处理后，无论是免疫细胞数量还是炎症因子转录表达量均显著下降。因此， NPs 暴露导致斑马鱼幼鱼显著的免疫炎症反应，而硝普钠的处理则显著缓解了免疫炎症反应 。

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