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上海交通大学白晓慧课题组WR：含氯饮用水中活的损伤细菌的自修复与复苏——无色杆菌为例

时间：2023-10-03 来源：浏览：

上海交通大学白晓慧课题组WR：含氯饮用水中活的损伤细菌的自修复与复苏——无色杆菌为例

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第一作者： 胡曾一（上海交通大学）

通讯作者： 白晓慧教授（上海交通大学）

论文DOI ： 10.1016/j.watres.2023.120585

图片摘要

成果简介

近日，上海交通大学白晓慧教授课题组在 Water Research （影响因子 12.8 ）上发表了题为 “Self-repair and resuscitation of viable injured bacteria in chlorinated drinking water: Achromobacter as an example” 的研究论文（ DOI: 10.1016/j.watres.2023.120585 ），探究了饮用水氯化消毒后，幸存的损伤细菌在输配过程中的自修复与复苏过程。研究人员发现氯化消毒可诱导细菌在流式细胞术分析（ FCM ）中出现中间的损伤状态，这实际上是细菌进入存活但不可培养（ VBNC ）状态的重要特征。无色杆菌从实际的含氯饮用水中被分离和获得培养，并作为研究的模式物种。研究表明，不完全氯化消毒后，细菌的膜结构与 DNA 发生了损伤，但细胞仍有潜在活性。活的损伤细菌可通过非同源末端链接（ NHEJ ）途径完成 DNA 修复，并在饮用水输配系统（ DWDSs ）中产生复苏风险。

全文速览

含氯饮用水中损伤细菌的潜在活性及复苏风险尚未被研究者广泛认知。本文以流式细胞术（ FCM ）分析中的“中间状态”细胞群为基础，建立了一种饮用水中存活损伤细菌的识别和获得方法。无色杆菌为研究样本中的优势物种，也是一种多重抗生素耐药的条件致病菌，其在氯损伤后自修复与复苏机制被进一步研究。 1.2 mg/L 的自由氯消毒后，无色杆菌在 FCM 点阵图上进入“中间状态”，标志着细胞膜完整性的丧失。同时，电镜图像直接捕获了细胞表面的形貌学损伤。然而，CTC呼吸活性检测显示 75.0% 的细菌仍具有生理活性，且这些活的损伤细菌进入了不可培养状态。使用无菌饮用水作为培养条件，约 25 h 后受损伤的无色杆菌发生了复苏。傅里叶红外变换光谱和彗星实验被用于探究损伤细菌的细胞修复过程。研究者发现 DNA 的修复对复苏发生至关重要，而膜结构未得到修复。 Ku 和 ligD 在修复期间表达水平显著上调，表明非同源末端链接（ NHEJ ）途径对 DNA 双链断裂修复的重要作用。该研究加深了饮用水氯化消毒过程对细菌活性影响的认识，为城市供水氯化消毒工艺技术改进提供了支持。

引言

流式完整细胞计数（ FCM-ICC ）是一种不依赖培养性的饮用水微生物监测方法，其根据细胞膜的完整性区分活细菌与死细菌。然而，含氯饮用水中膜损伤细菌的潜在活性尚未在 FCM-ICC 中得到充分认识。活的损伤细菌经历长时间的管网运输，可能发生细胞结构的自修复，并在到达用户端龙头前发生复苏，造成微生物健康风险。本研究以 FCM 分析中的中间损伤状态细菌为基础，提出并试图解决以下问题：（ 1 ）中间状态细菌是否为含氯饮用水中潜在的活的损伤细菌？（ 2 ）活的损伤细菌能否在饮用水输配系统（ DWDSs ）中完成细胞结构的修复并复苏？（ 3 ）涉及损伤细菌自修复与复苏的核心生物学机制是什么？

图文导读

饮用水中间状态细菌的分选与培养

Fig. 1. FCM cell sorting and cultivation of injured bacteria. (a) The gating strategy for intermediate-state bacteria in FCM analysis. (b) The target area in FCM cell sorting. (c) Correlation between the culture rate of injured bacteria and total chlorine in the water samples

在含氯饮用水的 FCM 分析中，观察到独特的“中间状态”细胞群，被认为可能包含活的损伤细菌。被分选的中间状态细胞在 96 孔板中获得 0.39%-6.5% 的培养率，而在琼脂平板上仅获得 0.08%-2.6% 的培养率。此外，损伤细菌的培养率与水样中的总氯浓度呈现强的负相关性。

饮用水样本中可培养损伤细菌的物种组成

Table 1. Composition of culturable injured bacteria isolated from the drinking water samples

在获得培养的损伤细菌中，无色杆菌 Achromobacter 为优势物种，并且是一种具有多重抗生素耐药性的条件致病菌。因此，无色杆菌被选为本研究中的模式物种，其在氯损伤后的自修复和复苏过程被进一步探索。

无色杆菌氯处理后细胞膜损伤的发生

Fig. 2. FCM cell integrity analysis of Achromobacter treated with various doses of chlorine. (a) 0 mg/L. (b) 0.4   mg/L. (c) 0.8   mg/L. (d) 1.2   mg/L. (e) 1.6   mg/L. (f) 2.0 mg/L

Fig. 3. Morphological characteristics of chlorine-injured Achromobacter under SEM (scanning electron microscopy) and TEM (transmission electron microscopy)

氯消毒前，绝大多数无色杆菌在流式点阵图上出现在完整细胞区和破坏的细胞区，即所谓的“活”细胞区和“死”细胞区。随着氯消毒剂量的提升，细菌细胞膜的渗透性改变并引起胞内荧光信号的变化，细胞群逐渐偏移并进入中间损伤状态。扫描电镜和透射电镜观察到了中间状态无色杆菌细胞表面的皱缩和粗糙化，这意味这细胞膜和细胞壁结构的损伤。然而，未发现细胞质内容物的泄露，损伤的细菌仍维持细胞的基本形态。

损伤无色杆菌的呼吸活性和复苏情况

Fig. 4. CTC respiratory activity assay of Achromobacter . (a) Intact and viable Achromobacter cell counts after treatment with various doses of chlorine. (b) Levels of respiratory activity (calculated by the average florescence intensity per cell)

Fig. 5. Resuscitation of injured VBNC Achromobacter in sterile drinking water

氯消毒显著减少无色杆菌的完整细胞计数，但活细胞计数的变化与之相比并不明显。 1.2 mg/L 的氯消毒剂使 99.9% 以上的无色杆菌丧失了细胞膜完整性，但此刻的 CTC 呼吸活性分析显示，仍有 75.0% 的细菌具有一定的生理活性。这些氯损伤的无色杆菌进入了存活但不可培养的（ VBNC ）状态，并在无菌的饮用水中被成功复苏。在不同批次的实验中，损伤细菌的复苏分别发生在 25 h ， 28 h 和 29 h 。

VBNC 损伤无色杆菌复苏前的细胞膜修复过程

Fig. 6. Exploring the cell membrane repair behavior of injured Achromobacter . (a) FCM cell integrity analysis of Achromobacter at different times after chlorine disinfection. (b) Bar graph showing bacterial number in FCM analysis. (c) FTIR-ATR spectra of the membrane lipids extracted from Achromobacter at different times after chlorine disinfection

使用流式细胞术（ FCM ）持续追踪受损后的无色杆菌的细胞膜渗透性变化。中间状态损伤细菌的数量直至消毒后的 25 h 未出现显著变化，表明新分裂的子代细胞可能来自于膜损伤的母细胞。提取了无色杆菌的细胞膜脂质并进行红外光谱分析，发现在无菌饮用水中孵育 10 h 和 20 h 的损伤细菌的膜脂仍拥有明显的氧化结构特征，且过氧化程度与刚结束氯消毒时相近。以上结果与 FCM 一致，即细胞膜的修复可能不是损伤无色杆菌复苏的必要准备。

VBNC 损伤无色杆菌复苏前的 DNA 修复过程及相关基因表达

Fig. 7. Comet assay of Achromobacter at different times after chlorine disinfection. (a) Representative comet images of untreated cells and injured cells at 0 h, 10 h and 20 h after treatment. (b) Quantitative evaluation of DNA damage degree

Fig. 8. Gene expression of Achromobacter after chlorine disinfection

通过彗星实验对无色杆菌的DNA损伤进行可视化和定量分析。细菌在氯处理后的彗星图像出现明显的“拖尾”，标志着较严重的DNA损伤。然而损伤细菌在饮用水中孵育10 h后，彗星拖尾的长度减短，并在孵育20 h后几乎消失，基因组已恢复最初的完整性。同时，RT -qPCR的结果表明， Ku 和 ligD 的基因表达水平在修复过程中显著上调，非同源末端链接（NHEJ）途径在DNA的双链断裂修复中发挥了重要作用。自然界中仅有20-25%的细菌具有该修复装置，它们可能因此被赋予了强大的DNA修复能力，在氯消毒后完成DNA损伤修复并在DWDSs中造成复苏风险。

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小结

这项工作揭示了饮用水处理工艺中，不完全的氯化消毒可使细菌进入中间损伤状态，这实际上也是细菌进入存活但不可能培养（ VBNC ）状态的重要表征。活的损伤细菌在完成 DNA 修复后，可在饮用水分配系统（ DWDSs ）中发生复苏，并造成健康风险。该工作有助于更准确评价饮用水氯消毒后的微生物灭活效率，并为控制 DWDSs 中的微生物增殖提供理论支持。

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作者简介

第一作者：胡曾一， 上海交通大学生命科学技术学院 2021 级硕士研究生。研究方向为饮用水净水工艺，饮用水微生物风险及控制。在 Water Research 期刊发表论文 1 篇。

通讯作者：白晓慧， 上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室教授，博士生导师。主要研究方向 : 饮用水水质生物学与过程控制。在 Water Research, Journal of Hazardous Materials, Science of the Total Environment, Environmental Pollution, Chemsphere 等中英文期刊发表论文 100 余篇。

参考文献：

Hu, Z., Bai, X., 2023. Self-repair and resuscitation of viable injured bacteria in chlorinated drinking water: Achromobacter as an example. Water Res. 245, 120585.

文章链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0043135423010254

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